风寒方对豚鼠咳嗽反射敏感性及肺组织P物质水平影响的实验研究*

谈馨媛，林珍珍，吴　蕾，林　琳

（1.广东省中医院，广州510120；2.广州中医药大学第二临床医学院，广州510405）

风寒方对豚鼠咳嗽反射敏感性及肺组织P物质水平影响的实验研究*

谈馨媛1，林珍珍2，吴蕾1，林琳1

（1.广东省中医院，广州510120；2.广州中医药大学第二临床医学院，广州510405）

［目的］评价风寒方对咳嗽反射敏感性影响并探讨气道神经源性炎症的作用靶点。为进一步新药开发研究提供一定的实验依据。［方法］采用枸橼酸引咳法建立咳嗽模型豚鼠，按随机数字表法随机分为空白对照组、空白模型组、抗病毒口服液组、风寒方低剂量组、风寒方高剂量组。1周后对各组动物采用小动物体描仪测定豚鼠的咳嗽反射敏感性（CRS），酶联免疫吸附（ELISA）法测定各组豚鼠肺组织匀浆P物质（SP）水平。［结果］与空白模型组比较，风寒方两组干预组显示出改善咳嗽反射敏感性的作用（P＜0.05）。抗病毒口服液组、风寒方低剂量组、风寒方高剂量组间比较，SP无统计学差异（P＞0.05）。［结论］风寒方干预组具有改善咳嗽反射敏感性的作用。

咳嗽；神经源性炎症；风寒方

DOI：10.11656/j.issn.1673-9043.2015.04.09

咳嗽是呼吸科最常见的主诉。但现代医学尚缺乏治疗亚急性/慢性咳嗽的公认有效的药物。中医诊治咳嗽历史悠久，中医药治疗咳嗽尤其是“顽咳”“久咳”具有一定优势［1-4］。本科牵头完成的“十一五”国家科技支撑计划结果显示风寒方治疗风寒恋肺型感染后咳嗽有较良好的疗效。本文采用对比干预的研究方法，从咳嗽反射敏感性（CRS）、肺组织匀浆P物质（SP）等变化了解风寒方对咳嗽豚鼠的影响，初步评价风寒方治疗咳嗽的作用靶点，为新药开发提供一点实验基础。

1　材料与方法

1.1动物雄性清洁级豚鼠，体质量200～300 g。由广州市花都区东信华实验动物养殖场提供，动物许可证号：SCXK（粤）2014-0023。本实验得到广东省中医院实验动物伦理委员会批准，所有的动物实验操作均依照广东省中医院实验动物委员会规定的协议及相关推荐进行。

1.2中药风寒方水煎剂（麻黄、苦杏仁、生姜等组成，剂量比例1∶2∶2，将药材冷水浸泡后煮沸15 min，滤过，煎出液于水浴上浓缩至每1 mL相当于药材量2 g药液），抗病毒口服液（广州香雪制药股份有限公司生产国药准字：Z10890017，批号：21302028）。

1.3试剂与仪器辣椒素购自Sigma；P物质ELISA检测试剂盒购自武汉华美公司。单腔非限制型小动物体描仪（型号AUT6100）。超高速低温离心机（型号：AllegraX-22RCentrifuge），移液器（10μL，100μL，200 μL）

1.4实验分组及模型制备清洁级雄性豚鼠75只，按随机数字表法随机分为5组：空白对照组、风寒方高剂量组、风寒方低剂量组、抗病毒口服液组、空白模型组。平均每组15只。

枸橼酸引咳法咳嗽豚鼠模型：将豚鼠放入密闭容器中，用超声雾化器喷入17.5%枸橼酸雾化气雾化5～10 s。见豚鼠出现胸腹收缩运动，并有咳嗽动作或声音时为造模成功。

1.5给药方式给药剂量根据等效剂量折算法计算：1）空白对照组：生理盐水2 mL，每日1次，灌胃。2）风寒方低剂量组：中药水煎剂2 mL，每日1次，灌胃。3）风寒方高剂量组：中药水煎剂4 mL，每日1次，灌胃。4）抗病毒口服液组：抗病毒口服液2 mL，每日1次，灌胃。5）空白模型组：生理盐水2mL，每日1次，灌胃。给药时间4 d。

1.6观察项目

1.6.1咳嗽反射敏感性（CRS）本研究应用单腔非限制型小动物体描仪来测定豚鼠的CRS，各组动物分别在预定时间进行辣椒素咳嗽激发实验，判断CRS的指标主要是咳嗽总次数（CCnt）［5］，小动物肺功能系统通过采集气流变化信号，计算曲线下面积（V2）以及气流半数峰值转换时间，经过模拟方程换算后判断是否为咳嗽动作。辣椒素激发溶液浓度为50 μmol/L，总量为1mL，观测记录10 min（含雾化时间）内的CCnt。

1.6.2肺组织匀浆P物质水平（SP）称取100mg新鲜豚鼠肺组织，先加0.1 mol/L醋酸0.3 mL，100℃水浴10 min以灭活内源性激肽酶活性，然后按比例加入一定量的磷酸盐缓冲液（PBS），用1～3 mL玻璃匀浆器匀浆，3 500 r/min离心20 min，取上清-70℃保存，或水浴后-70℃保存，用前匀浆。酶联免疫吸附（ELISA）法检测豚鼠肺组织SP的含量。

1.7统计学分析采用SPSS22.0统计软件进行数据录入及统计分析，计量资料为偏态分布，以中位数（M）四分位数间距（QR）表示，组间比较采用Kruskal-Wallis法，两两比较采用Nemenyi检验，P＜0.05为差异有统计学意义。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较用t检验。多组间比较采用单因素方差分析。

2　结果

2.1各组豚鼠CRS咳嗽激发实验是反映CRS的一个具体指标。与空白模型组比较，风寒方高、低剂量组显示出改善CRS的作用，与空白对照组、空白模型组比较，有较显著差异（P＜0.05）。而抗病毒口服液干预组同模型组比较，无统计学差异。风寒方不同剂量组之间CRS值比较亦无统计学差异。见表1。

表1　各组豚鼠CRS比较

2.2各组豚鼠肺组织匀浆P物质水平ELISA法检测豚鼠肺组织SP的含量。各药物干预组与空白模型组比较，差异无统计学意义。但风寒方低剂量组及抗病毒口服液组均有改善肺组织神经源炎性物质释放的趋势。见表2。

表2　肺组织匀浆SP含量比较pg/mg

根据实验结果，再次对药物干预组取材的肺组织匀浆行蛋白浓度滴定，进一步矫正P物质（pg/mg）含量。通过蛋白浓度滴定的矫正后，虽然各药物组间仍没有统计学差异。但可见抗病毒口服液组及风寒方低剂量组有改善肺组织神经源炎性物质释放的趋势。结果如表3。

表3　药物干预组肺组织匀浆SP含量比较（蛋白浓度滴定矫正后）pg/mg

3　讨论

目前慢性咳嗽，尤其是感染后咳嗽的机制研究所知甚少，一般认为，咳嗽感受器的CRS异常增高是导致感染后咳嗽机体发生咳嗽反应十分重要的原因［6-11］。

SP是一种最常见的速激肽，SP及其受体广泛分布于呼吸系统的气道上皮，黏膜下腺体、肌细胞、血管等部位，主要由C纤维末梢释放，是气道神经源性炎症的核心介质。SP参与咳嗽反射的作用已被许多研究证实［12］。而上呼吸道感染后黏膜损伤，神经末梢暴露，SP等神经肽释放增高引起神经源性炎症是导致CRS升高的关键原因。

中医认为，外感咳嗽多是六淫邪气外侵，肺气失宣，清肃失常，肺气不利，痰生气逆所致［13］。所以外感咳嗽的治疗应以透邪为先，宣肃肺气为主。风寒方以“疏风透邪宣肺止咳”立法，针对感染后咳嗽“外邪袭肺，肺失宣肃”的主要病机特点化裁而制，且经过本专科牵头完成的国家“十一五”科技支撑计划临床试验验证。

本研究则采用对比干预的研究方法，将风寒方干预组同抗病毒口服液干预组、空白模型组及空白对照组干预的咳嗽模型豚鼠进行对照，结果显示：风寒方干预能改善咳嗽豚鼠的CRS：无论是风寒方低剂量组还是风寒方高剂量组，与空白模型组比较，组间均有统计学差异。虽然不同剂量组之间CRS值比较无统计学差异，但在今后的实验中增加动物实验例数或可发现变化趋势。风寒方干预有改善肺组织神经源炎性物质释放的趋势：虽然风寒方高剂量、低剂量、抗病毒口服液与空白模型组相比，均未能明显改善豚鼠肺组织匀浆的SP含量。无论是蛋白浓度滴定矫正前还是矫正后，均可见风寒方低剂量组及抗病毒口服液组有改善肺组织神经源炎性物质释放的趋势。今后增加动物实验例数或可进一步发现变化趋势。

本研究虽然受实验经费、实验周期、实验动物例数、实验经验等多方面的限制，未能得出明确的阳性结果，但结论仍可以提示，风寒方有改善豚鼠CRS的作用，其作用靶点可能是降低肺组织神经源性炎症释放。

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Study of the changes of Fenghan Fang on cough reflex sensitivity and substance P content in lung homogenates in cough guinea pigs

TAN Xin-yuan1，LIN Zhen-zhen2，WU Lei1，LIN Lin1
（1.Guangdong Province Traditional Chinese Medical Hospital，Guangzhou 510120，China；2.Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510405，China）

［Objective］To investigate the changes of cough reflex sensitivity and airway neurogenic mechanism in cough guinea pigs of Fenghan Fang’s influence.Then we can discovery the target point of treatment and make foundation for new medicine.［Methods］Guinea pigs cough test induced by citric acid were randomly divided into normal control group and the model group，the Peroral Liquids of Kangbingdu group，the low dose of Fenghan Fang control group，the high dose of Fenghan Fang control group.The plethysmograph was used to assess cough reflex sensitivity.Substance P（SP）content in lung homogenates was assayed by ELISA.［Results］The CRS of Fenghan Fang control groups were significantly lower than that in control group（P＜0.05）.The SPA was no statistically significant differences in Peroral Liquids of Kangbingdu group，and two groups of Fenghan Fang controled（P＞0.05）.［Conclusion］Fenghan Fang can reduce cough guinea pigs's CRS.

Cough；Neuogenic inflammation；Fenghan Fang

R285.5

A

1673-9043（2015）04-0226-03

广东省中医药局（粤中医［2013］17号）；2013年建设中医药强省资助项目（20131177）。

谈馨媛（1981-），女，硕士，主治医师，研究方向为慢性阻塞肺疾病和慢性咳嗽的中医药治疗。

（2015-04-21）