基于脑-肠轴探讨腹部推拿对促进大鼠乙醇性胃黏膜损伤修复的作用机制

时间：2024-08-31

海兴华,刘芳,骆雄飞,李华南,张玮,王海腾,孙庆

海兴华,刘芳,骆雄飞,李华南,张玮,王海腾,孙庆,天津市中医药大学第一附属医院天津市 300381

0 引言

胃黏膜损伤是导致胃溃疡及急慢性胃炎的主要病理生理环节[1].腹部推拿作为传统的中医外治法之一,相关临床研究已经证实其能够促进胃黏膜损伤修复,是中医治疗胃黏膜损伤性疾病的有效方法[2-4].脑-肠轴是指通过中枢或外周神经系统将胃肠道与大脑联系起来的神经-内分泌网络,具有双向调节作用[5],目前认为是腹部推拿治疗消化系统疾病的基础[6,7].已有研究表明,肠三叶因子(intestinal trefoil factor,ITF)在急性胃黏膜损害过程中可以起到保护胃黏膜的作用[8,9],当胃黏膜损伤发生时,ITF则可通过神经内分泌途径到达胃脏,从而发挥促进胃黏膜修复的作用[10].基于此,本研究通过分析比较乙醇性胃黏膜损伤大鼠神经内分泌系统中相关因子的表达变化,探讨腹部推拿促进胃黏膜损伤修复的作用机制,并验证脑-肠轴在此过程中的桥梁作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:选用SPF级健康成年SD大鼠30只,6-8周龄,雌雄不限,体质量(200±20) g(北京华阜康生物科技股份有限公司,合格证:SCXK(京)2014-0004).

1.1.2 主要试剂:无水乙醇(科密欧,天津);GAS ELISA kit(武汉云克隆科技股份有限公司中国),NPY ELISA kit(武汉云克隆科技股份有限公司,中国);UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司,中国);Real-time qPCR试剂盒(Sigma,美国);ITF ELISA kit(武汉云克隆科技股份有限公司,中国).

1.1.3 主要仪器:AL204型分析天平(Mettler-toledo Instruments公司,瑞士);KJ-201型振荡器(江苏康健医疗用品有限公司,中国);DU800-核酸蛋白分析仪(Beckman Coulter公司,美国);ABI7500型实时荧光定量PCR仪(Applied Biosystems 公司,美国);DW-86L628型-80 ℃立式超低温保存箱(Haier公司,中国).

1.2 方法

1.2.1 造模方法:采用无水乙醇灌胃法复制胃黏膜损伤大鼠模型.适应性饲养7 d后,除空白对照组外,其余实验大鼠均禁食不禁水24 h后,按照5 mL/kg的剂量行无水乙醇灌胃1次.模型成功的标准是无水乙醇灌胃后实验大鼠胃黏膜出现条状出血坏死,病理切片可见腺体破坏、炎性细胞浸润等损伤表现.造模后2 h即进行实验观察.

1.2.2 分组与干预方法:采用随机对照的研究方法,运用随机数字表法将造模成功的胃黏膜损伤大鼠分为腹部推拿组和模型组,每组各10只.同时设置10只大鼠作为空白对照组.腹部推拿组干预操作方法:将实验大鼠仰卧位束缚于实验台上.操作者右手食指、中指伸直并拢,其余三指屈曲放松,以食指、中指指腹于实验大鼠腹部,利用腕关节带动二指做回旋揉动,揉动频率为20-30 次/min,操作10 min,连续治疗21 d,每日正常饲食喂水.模型组每天将实验大鼠束缚于试验台10 min,不予任何干预.空白对照组不予任何干预.

1.2.3 标本采集:血清:所有大鼠断头处死后,快速取血至离心管中,离心机低温4 ℃离心20 min(3000转/分),用移液枪收集上清液至冻存管中,放入冰箱-20 ℃保存;脑组织:取血后立即分离出大脑组织用锡箔纸封存标记后浸入液氮中急冻,后移至-80 ℃低温冰箱保存.结肠组织:脑组织取材后,迅速打开腹腔,立即剪取50-100 mg结肠组织,放置于2 mL冻存管中,于液氮中保存备用.

1.2.4 ELISA法检测结肠组织和下丘脑中GAS、NPY的表达:将保存的脑组织分离出下丘脑组织,连同结肠组织分别以无菌剪刀剪成匀浆;将匀浆放入1.5 mL离心管中,离心机离心半径75 mm,2500 r/min离心20 min,仔细收集上清液,放入另外的1.5 mL离心管中;采用ELISA法分别检测结肠组织和下丘脑样本中胃泌素(gastrin,GAS)、神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)的水平,操作严格按照说明书要求进行操作.

1.2.5 实时定量RT-PCR技术检测下丘脑和胃黏膜组织中ITF mRNA表达:Trizol法分别提取下丘脑和胃黏膜组织总RNA.计算RNA浓度和纯度,按照试剂盒说明进行反转录,用引物(表1)扩增并检测.反应条件:50 ℃ 5 min,95 ℃ 15 min,95 ℃ 15 min,60 ℃ 15 min.扩增反应在ABI 7500型实时荧光定量PCR仪上进行,反应结束后电脑自动绘制出标准曲线,并由仪器自带软件进行分析.溶解曲线分析:先将PCR产物升温至95 ℃,15 s后降温至60℃,维持1 min后再升温到95 ℃维持15 s,最后再降温至60 ℃维持15 s.在此过程中连续收集荧光信号,并绘制熔解曲线进行.

表1 ITF及内参基因引物序列

1.2.6 ELISA法测定血清中ITF的含量:取实验大鼠血清进行ELISA法检测,具体操作步骤同GAS和NPY含量检测.

统计学处理实验数据采用mean±SD表示,利用SPSS 19.0统计软件进行分析.两组数据比较采用t检验,多组数据两两比较,采用方差分析后Bonfferoni-t检验.P＜0.05为差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 结肠组织和下丘脑中GAS、NPY表达变化表2显示,与空白对照组比较,模型组大鼠下丘脑组织中GAS和NPY含量均显著降低,同时结肠组织中GAS含量显著降低,NPY含量显著升高,差异均具有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较,腹部推拿组大鼠下丘脑组织中GAS含量显著升高(P＜0.01),NPY含量有所升高(P＜0.05),同时结肠组织中GAS含量显著升高,NPY含量显著降低,差异均具有统计学意义(P＜0.01).

表2 结肠组织和下丘脑中GAS、NPY表达变化比较(mean±SD)

2.2 下丘脑中c-fos蛋白的表达

2.2.1 下丘脑中c-fos蛋白免疫组化实验结果:图1显示,相对于空白对照组,模型组c-fos蛋白的表达显著增强;经腹部推拿后,c-fos蛋白的表达显著降低.

图1 c-fos蛋白免疫组化染色结果(×40).A:空白对照组;B:模型组;C:腹部推拿组.

2.2.2 下丘脑中c-fos蛋白Western Blot实验结果:图2显示,与空白对照组比较,模型组c-fos蛋白表达被显著上调;与模型组比较,腹部推拿组c-fos蛋白的表达被显著下调,与免疫组化结果一致.

图2 Western Blot分析下丘脑中c-fos蛋白表达.A:空白对照组;B:模型组;C:腹部推拿组.

2.3 实时定量RT-PCR分析下丘脑和胃黏膜组织中ITF的mRNA表达

2.3.1 腹部推拿对下丘脑中ITF mRNA表达的影响:图3显示,与空白对照组比较,模型组大鼠下丘脑中ITF mRNA表达水平下降,差异具有统计学意义(P＜0.05);与模型组比较,腹部推拿组大鼠下丘脑中ITF mRNA的表达水平显著上升,差异具有统计学意义(P＜0.01).

图3 腹部推拿对下丘脑肠三叶因子mRNA(ITF mRNA)表达的影响.与空白对照组比较,aP＜0.05;与模型组比较,bP＜0.01.

2.3.2 腹部推拿对胃黏膜中ITF mRNA表达的影响:图4显示,与空白对照组比较,模型组大鼠胃黏膜中ITF mRNA表达水平显著下降,差异具有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较,腹部推拿组大鼠胃黏膜中ITF mRNA的表达水平上升,差异具有统计学意义(P＜0.05).

图4 腹部推拿对胃黏膜肠三叶因子mRNA(ITF mRNA)表达的影响.与空白对照组比较,aP＜0.01;与模型组比较,bP＜0.05.

2.4 ELISA法测定血清中ITF的含量图5显示,与空白对照组比较,模型组血清中ITF水平被下调,而给予腹部推拿后,血清中ITF水平被显著上调,差异具有统计学意义(P＜0.01).

图5 血清中肠三叶因子(ITF)水平变化.与空白对照组比较,aP＜0.05;与模型组比较,bP＜0.01.

3 讨论

胃黏膜柔软、血供丰富,是胃壁屏障的重要物质基础,由于其与外界直接相通,极易受到各种物理、化学因素等多种内外攻击因子的刺激,发生损伤,从而导致消化性溃疡、各型急慢性胃炎等胃黏膜损伤性疾病[11].目前认为胃黏膜损伤形成的主要病理环节为胃黏膜保护机制与损伤因素之间的失衡.

脑-肠轴是由肠神经系统、椎前神经节和中枢神经系统三个层次的神经调节系统共同组成的神经内分泌网络,其将胃肠道与中枢神经系统紧密联系起来.相关研究[6,7]已经证实了腹部推拿可以通过脑-肠轴调控中枢神经系统,以达到治疗消化系统疾病的作用.本研究发现,造模后的胃黏膜损伤大鼠结肠组织和下丘脑中GAS和NPY神经肽的含量均有明显改变,而经腹部推拿干预后大鼠结肠组织和下丘脑中GAS和NPY的含量均有改善,提示腹部推拿可以同时改善胃黏膜损伤大鼠结肠组织和下丘脑中GAS和NPY神经肽的含量,说明了腹部推拿作用于大鼠腹部后,可以对中枢神经系统起到调控作用,同时也进一步验证了脑-肠轴的存在,以及脑-肠轴在腹部推拿促进胃黏膜损伤修复过程中的桥梁作用.

c-fos蛋白是神经元被激活的标志,可有效地用于神经通路追踪和信使传递途径的研究[12].本研究显示,腹部推拿干预可以减少下丘脑中c-fos蛋白的表达,下调应激反应强度,也充分证明腹部推拿可以激发下丘脑组织的神经内分泌功能,具有中枢应激调节作用.

ITF是新型保护性因子三叶草因子家族中的一员,有研究显示,其主要由下丘脑合成,较其他保护性因子表达更加迅速,在胃黏膜损伤早期即可参与到损伤组织的修复过程中,具有重要的临床价值[13,14].但本研究结果显示,模型组大鼠下丘脑、血清及胃黏膜组织中ITF表达水平较空白对照组均有所下降,可能与检测时间点较晚有关;而腹部推拿干预后实验大鼠下丘脑、血清及胃黏膜组织中ITF的表达水平较模型组均显著增加,证明了腹部推拿能刺激下丘脑释放ITF入血,并作用于胃黏膜,从而发挥修复胃黏膜的作用.在以后的研究中,可以通过增加样本量和检测时间点进一步观测各组织中ITF表达水平变化.