酪酸梭菌活菌片对结直肠癌术后FOLFOX4方案化疗肠道菌群平衡、毒副反应及免疫炎症指标的影响

王 沁,龚黎明,郑 惠

王沁,金华市第二医院检验科 浙江省金华市 321000

龚黎明,郑惠, 兰溪市人民医院检验科 浙江省兰溪市 321100

0 引言

流行病学调查显示,结直肠癌发病率居我国全身恶性肿瘤的第4位,并随生活水平提高、饮食结构改变逐渐增长与年轻化[1,2].手术切除是结直肠癌主要治疗手段,但Ⅱ-Ⅲ期患者手术切除后仍存在较大复发或转移风险,故术后实施辅助化疗十分必要[3].然而相关研究显示[4,5],结直肠癌手术可破坏正常肠道菌群,诱导肠道菌群易位,进而增加术后全身炎症反应综合征发生率,且化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时会对正常组织细胞造成不同程度损害,进而增加毒副反应发生率.有学者指出,酪酸梭菌活菌片属益生菌,可直接补充因化疗或手术所致机体欠缺的生理细菌,调节肠道菌群系统,增强机体免疫功能[6,7],但关于其与FOLFOX4方案化疗联合对结直肠癌免疫炎症、肠道菌群的影响缺乏相关研究.基于此,本研究首次尝试分析酪酸梭菌活菌片联合亚叶酸钙+氟尿嘧啶+奥沙利铂(folinate 5-fluorouracil oxaliplatin,FOLFOX4)方案化疗对结直肠癌术后肠道菌群平衡、毒副反应及免疫炎症指标的影响.

1 材料和方法

1.1 材料 选取2017-04/2020-05我院结直肠癌术后患者92例,纳入标准:(1)结直肠癌诊断标准均参照《2016 USPSTF建议声明:结直肠癌筛查》[8],并均经肠镜、腹部CT或病理组织学检查确诊;(2)均符合手术适应证;(3)预计生存期＞3 mo;排除标准:(1)存在手术禁忌证者;(2)合并原发性慢性肠炎、炎症性肠病及肠易激综合征等疾病者;(3)伴有急性肠梗阻、穿孔者;(4)术中发现肿瘤广泛转移、浸润,无法实施手术切除者;(5)近4 wk内有微生态制剂、免疫抑制剂等药物使用史者;(6)合并肝肾等其他重要脏器器质性功能损害者;(7)处于妊娠期、产褥期或哺乳期等特殊时期者;(8)患有慢性炎症感染性疾病者;(9)意识不清或精神欠佳者.简单随机化法分为研究组(n＝ 46)、对照组(n＝ 46).本研究经我院医学伦理委员会批准,所有研究对象均签署知情同意书.

1.2 方法 两组均实施手术治疗,术后均密切观察患者生命体征,并予以营养支持、抗感染、镇痛等对症处理.

1.2.1 对照组:根据患者病情恢复情况在术后14 d内采用FOLFOX4方案化疗治疗,即d1,静脉滴注奥沙利铂(正大天晴药业集团股份有限公司,国药准字H20143263,规格:50 mg)85 mg/m2,时间为120 min;d1-2,静脉滴注亚叶酸钙[江苏奥赛康药业有限公司,国药准字H20060197,规格:100 mg(按亚叶酸计)]200 mg/m2,时间为120 min,静脉滴注完毕后,静脉注射5-氟尿嘧啶(吉林通化茂祥制药有限公司,国药准字H22023469,规格:10 mL:0.25g)400 mg/m2,后改为静脉滴注600 mg/m2,时间为4 h.

1.2.2 研究组:在对照组基础上术后第1 d起口服酪酸梭菌活菌片(青岛东海药业有限公司,国药准字S20040083,规格:每片350 mg,含酪酸梭菌活菌片数不低于1.5×107CFU/g),700 mg/次,3次/d.两组均以2 wk为1个疗程,持续治疗8 wk.

1.2.3 检测方法:(1)空腹取9 mL肘静脉血:①通过流式细胞仪检测CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平,严格参照常州必达科生物科技有限公司提供的仪器说明书操作;②加入8%高氯酸(2 mL)混匀,采用酶学分光光度法测定血浆D乳酸,严格参照上海必优生物科技有限公司提供的试剂盒说明书操作;③1000×g离心15 min(离心半径8 cm),分离取血清,置于-20 ℃低温保存,利用酶联免疫吸附试验检测血清糖类抗原724(carbohydrate antigen724,CA724)、糖类抗原199(carbohydrate antigen199,CA199)、癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin,IL-6)水平,运用免疫比浊法测定血清C反应蛋白(CRP)水平,严格参照南京泽维尔生物科技有限公司提供的试剂盒说明书操作.(2)取0.5 g新鲜粪便,添加生理盐水(0.9%),持续稀释10倍至10-9,分别取0.5 mL 10-1、10-3、10-5、10-7、10-9稀释液,对粪肠球菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌进行培养,分别接种于羊血平板培养基、兰琼脂平板培养基、MRS营养琼脂平板培养基与BS血琼脂平板培养基,其中粪肠球菌、大肠杆菌放置于35 ℃孵箱培养1 d,乳酸杆菌、双歧杆菌以抽气换气培养法培养2 d,计算每克粪便湿重中菌落形成单位(CFU)的对数值[9].(3)取新鲜粪便0.5 g,根据1:3比例稀释混匀生理盐水,2500 r/min离心15 min,去上清液过滤,运用透射比浊法测定粪便分泌型免疫球蛋白A(SIgA)水平,严格参照上海名典生物工程有限公司提供的试剂盒说明书进行操作.

1.3 观察指标 (1)比较两组一般资料;(2)比较两组治疗前、治疗8 wk后血清肿瘤标志物,即CA724、CA199、CEA水平;(3)比较两组治疗前、治疗8 wk后免疫功能指标,即CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平;(4)比较两组治疗前、治疗8 wk后血清炎症反应指标,即TNF-α、CRP、IL-6水平;(5)比较两组治疗前、治疗8 wk后肠道菌群指标,包括粪肠球菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量;(6)比较两组治疗前、治疗8周后肠道屏障功能指标,即血浆D乳酸、粪便S-IgA水平;(7)统计两组毒副反应,包括恶心呕吐、肢端麻木、白细胞减少、肝功能异常、血小板减少.

统计学处理采用SPSS22.0统计学软件处理数据,计量资料采取巴特利(Bartlett)方差齐性检验与科尔莫戈罗夫·斯米尔诺夫(Kolmogorov-Smirnov)正态性检验,均确认具备方差齐性且近似服从正态布,以mean±SD描述,t检验,计数资料用n(%)表示、χ2检验.P＜0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 一般资料 两组性别、年龄、体质量指数、病程、肿瘤部位、Dukes分期、分化程度、手术方式比较,差异无统计学意义,见表1.

2.2 血清肿瘤标志物水平 两组治疗前血清CA724、CA199、CEA水平相比,差异无统计学意义;两组治疗8 wk后血清CA724、CA199、CEA水平较治疗前降低,且研究组低于对照组(P＜0.05).见表2.

2.3 免疫功能指标 两组治疗前CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平相比,差异无统计学意义;研究组治疗8 wk后CD4+、CD8+、CD4+/CD8+水平与治疗前相比,差异无统计学意义,研究组治疗8 wk后CD4+、CD4+/CD8+水平高于对照组,CD8+水平低于对照组(P＜0.05).见表3.

2.4 血清炎症反应指标 两组治疗前血清TNF-α、CRP、IL-6水平相比,差异无统计学意义;两组治疗8 wk后血清TNF-α、CRP、IL-6水平较治疗前降低,且研究组低于对照组(P＜0.05).见表4.

2.5 肠道菌群指标 两组治疗前粪肠球菌、大肠杆菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量相比,差异无统计学意义;两组治疗8 wk后粪肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量较治疗前提高,且研究组高于对照组,大肠杆菌数量较治疗前降低,且研究组低于对照组(P＜0.05).见表5.

2.6 肠道屏障功能指标 两组治疗前血浆D乳酸、粪便S-IgA水平相比,差异无统计学意义;两组治疗8 wk后血浆D乳酸水平较治疗前降低,且研究组低于对照组,粪便S-IgA水平较治疗前提高,且研究组高于对照组(P＜0.05).见表6.

2.7 毒副反应 研究组恶心呕吐、肢端麻木、白细胞减少、肝功能异常发生率低于对照组(P＜0.05);两组血小板减少发生率相比,差异无统计学意义.见表7.

3 讨论

FOLFOX4方案化疗是结直肠癌术后常用化疗方案,可有效抑制机体癌细胞增殖、浸润、转移,减轻患者临床症状,延长患者生存周期[10],但其易引发恶心呕吐、肝功能异常、免疫功能低下等毒副反应,影响患者生存质量.因此,如何增强结直肠癌术后化疗患者抗肿瘤免疫应答水平、降低毒副反应发生率是目前临床亟需解决的问题.

CA724、CA199、CEA是临床常用肿瘤标志物,其在结直肠癌患者中过度高表达,与疗效、肿瘤临床分期、复发存在相关性[11-13].迪米拉·阿里根等[14]研究发现,在XELOX方案化疗治疗的同时联合双歧杆菌三联活菌,能有效降低结直肠癌术后肿瘤标志物水平,增强化疗抗肿瘤疗效.在此基础上,本研究首次于结直肠癌术后采用酪酸梭菌活菌片联合FOLFOX4方案化疗治疗,结果显示,二者联合能有效减少患者血清CA724、CA199、CEA水平,这可能是由于二者联合能发挥良好协同增效减毒作用,刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞成熟,双向调节免疫应答,增强免疫系统功能,抑制肿瘤细胞生长,诱导肿瘤细胞凋亡,从而降低血清肿瘤标志物水平,实现抗肿瘤作用.

同时,有学者指出[15,16],结直肠癌术后大肠杆菌数量明显增加,双歧杆菌与大肠杆菌比例下调,易破坏肠道原有肠黏膜生物屏障功能,明显改变肠道通透性,而肠黏膜屏障损坏则会进一步加重原有肠道微生态紊乱,最终形成恶性循环,加重患者病情.血浆D乳酸、粪便S-lgA是评估肠道黏膜屏障功能常用指标,其中血浆D乳酸是肠道固有细菌代谢物,随肠道黏膜屏障损伤程度加重,其含量明显增加[17];粪便S-lgA是肠黏膜主要免疫球蛋白,也是肠黏膜防御的重要组成部分[18].另外,一项大鼠实验表明[19],高剂量复合益生菌可增加肠道乳杆菌、双歧杆菌含量,调节肠道菌群.本研究数据表明,酪酸梭菌活菌片联合FOLFOX4方案化疗对纠正结直肠癌术后患者肠道菌群紊乱、修复受损肠黏膜屏障功能具有一定积极效应,与李灼非等[20]研究相似,这可能是由于酪酸梭菌活菌片剂量大,可提供充足有益菌,有效防止致病菌繁殖,恢复肠道菌群平衡,并可促进酪酸分解,分泌抗氧化、抗癌化合物短链脂肪酸,为肠道黏膜修复提供能量[21],与FOLFOX4方案化疗联合,通过生物夺氧功能,不仅能降低肠道定植部位氧浓度,调节厌氧菌群生长环境,维持肠道菌群平衡,还能改善肠道通透性,抑制D乳酸渗透入血及S-IgA流失,从而有效保护肠道黏膜屏障功能.

受手术治疗创伤、术中失血及麻醉等因素影响,结直肠癌患者术后处于应激状态,可能影响细胞免疫功能,引发继发性免疫功能缺陷,加之结直肠癌患者肠道菌群紊乱,肠道黏膜屏障功能损害,进一步抑制机体免疫应答[22,23].本研究通过对比研究可知,研究组治疗8 wk后CD4+、CD4+/CD8+水平高于对照组,CD8+水平低于对照组,提示酪酸梭菌活菌片联合FOLFOX4方案化疗能有效调节结直肠癌术后患者免疫功能,结合既往研究[24]分析可能与酪酸梭菌活菌片能纠正肠道菌群紊乱,维持肠黏膜屏障功能完整性有关.同时,结直肠癌患者大肠杆菌等致病菌异常增殖,会释放大量内毒素及细菌毒素,刺激肝巨噬细胞及其他相关炎症细胞,进而持续分泌TNF-α、CRP、IL-6等炎症因子,提高感染并发症发生率[25].本研究数据表明,酪酸梭菌活菌片联合FOLFOX4方案化疗在降低结直肠癌术后患者炎症反应

方面优于单纯FOLFOX4方案化疗治疗,这可能是由于酪酸梭菌活菌片通过外源性补充双歧杆菌、乳酸杆菌等益生菌,减少肠内细菌和内毒素移位,抑制炎症因子分泌,与FOLFOX4方案化疗联合,可激活吞噬细胞活性,刺激肠道局部免疫反应,增强机体抗感染能力,从而减轻炎症反应.进一步研究还发现,酪酸梭菌活菌片联合FOLFOX4方案化疗能有效降低恶心呕吐、肢端麻木、白细胞减少、肝功能异常发生率,可能与酪酸梭菌活菌片能保护神经细胞,减轻神经系统毒性,调节免疫炎症反应有关.

表 1 两组一般资料比较

表 2 两组血清肿瘤标志物水平比较(mean±SD)

表 3 两组免疫功能指标比较(mean±SD)

表 4 两组血清炎症反应指标比较(mean±SD)

表 5 两组肠道菌群指标比较(mean±SD,lg CFU/g)

表 6 两组肠道屏障功能指标比较(mean±SD)

表 7 两组毒副反应比较n (%)

4 结论

综上可知,酪酸梭菌活菌片联合FOLFOX4方案化疗通过纠正肠道菌群紊乱,修复受损肠黏膜屏障功能,有助于调节结直肠癌术后患者免疫炎症反应,降低血清肿瘤标志物水平,减少毒副反应.但本研究也存在一定不足,如涉及样本量较小,所得结论仅是初步的;未探讨其他益生菌是否有类似作用;缺少肠道菌群测序等,应进一步扩大样本量,采取多中心、深层次研究方法从微生物组学角度进行深度且全面分析,以便为研究结果提供理论与数据支撑.

文章亮点

实验背景

结直肠癌患者一旦进入中晚期,除了手术治疗外,还需要化疗药物进行术后的辅助治疗,化疗药物对身体免疫系统的破坏是比较明显的,且本身结直肠癌患者的消化功能也较差,因此能够增强肠道的吸收,进而增强机体免疫的辅助治疗就显得尤为重要.

实验动机

本研究从化疗药物对身体的影响和结直肠癌患者肠道吸收能力较差的角度出发,拟减轻化疗对身体免疫系统的破坏,同时能够增强肠道的吸收能力,保证机体能够正常运转,对结直肠癌患者的术后的恢复起到积极的作用.

实验目标

本研究旨在利用酪酸梭菌活菌片中有益菌改善肠道微生态条件改善由于结直肠癌的影响较差的肠道吸收功能,同时改善由于化疗药物的影响而造成的免疫功能的下降,为结直肠癌术后治疗提供有益于机体健康,毒副作用小的微生物疗法.

实验方法

本研究主要采用了用药后对各个指标检测、观察和分析的方法,通过对肠道菌群的检测,和对免疫相关指标的分析,从微环境和蛋白分子水平来判断酪酸梭菌活菌片对术后患者的作用效果.

实验结果

治疗后,与对照组相比,研究组的血清C A724、CA199、CEA、CD8+、TNF-α、CRP、IL-6水平、大肠杆菌数量、血浆D乳酸水平更低,CD4+、CD4+/CD8+水平、粪肠球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌数量、粪便S-IgA水平更高.研究组的不良事件发生率低于对照组.

实验结论

酪酸梭菌活菌片改善了结直肠癌患者肠道菌群的结构,增加了有益菌群的数量,降低了炎症因子的表达,促进了免疫功能的提升且无毒副作用,为进一步改善患者的生活质量提供了一种健康价廉的高效治疗方案.

展望前景

本研究样本仅限于我院收集的,多为本地区及周围的人群,数量相对较少,是否能够涵盖更广的人群还有待于进一步收集更多更广的样本量.肠道菌群较为复杂多样,其他相关菌群是否有影响没有探讨,后续将采用高通量测序等技术从微生物组学角度进行全面的分析,为研究结果提供更可靠的理论与数据支撑.