CMTM3在胃癌中的表达及其生物学功能研究

李爱云,吴玉秀,郜娜,张建光,武警特色医学中心检验科 天津市300162

孟薇,天津市东丽区东丽医院检验科 天津市 300300

0 引言

在全球范围内,胃癌(gastric cancer,GC)在男性是第3大常见恶性肿瘤,发病率仅次于肺癌、结直肠癌占所有肿瘤患者病例数的7%和死亡人数的9%[1].2018年,GC新发103万人,造成78.3万人死亡.20世纪30年代以前,在世界大部分地区,包括大多数西方发达国家,GC是最常见的死亡原因[2].然而,近1个世纪以来,世界上许多地区的GC发病率和死亡率都在下降.其原因可能与食品保鲜方法的改进以及食用较少的腌制食品有关.然而目前,GC在东亚尤其是我国和日本等国家仍为常见的恶性肿瘤[3-5].

GC整体预后较差,晚期患者5年生存率低.大部分患者发现时已发展远处转移的晚期或局部晚期,丧失了手术机会[6].然而,GC发生发展及侵袭转移的确切分子机制仍不完全明晰.近年来随着分子生物学技术的不断进步及大数据分析的不断发展,GC研究尤其是相关信号通路在其表型中的相关性取得了长足的进步.

CMTM为趋化素样因子家族(CKLFS),是一个新基因家族[7].CMTM3是趋化素样因子家族主要成员,在多种人体恶性肿瘤中呈现差异表达,并与细胞的恶性表型有关.但其上游靶基因及其相关分子调控机制并不十分清楚.在本研究中,我们采用生物信息分析结合细胞实验方法探讨CMTM3基因在GC中的表达、生物学功能及其潜在的分子调控机制.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系和组织标本:正常胃上皮细胞(GES-1)和多个GC细胞系(HGC-27,BGC-823和MKN45)购自中国科学院上海生科院细胞资源中心.选取我院手术治疗的15例GC患者,术中留取患者癌组织和癌旁正常组织标本后立即置入液氮中迅速冷冻,然后转移到-80 ℃冰箱中保存.组织标本获取经我院医学伦理委员会及家属知情同意.

1.1.2 仪器与设备:台式低速离心机(B160A型);荧光定量PCR仪7500HT;超低温冰箱;无菌操作台 Steril CARD Ⅲ Advance;台式微型离心机(Mierofuge18).

1.2 方法

1.2.1 生物信息分析:在GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)[8,9]和TCGA(https://portal.gdc.cancer.gov/)[10]数据库中分析CMTM3基因的差异表达情况.CMTM3差异表达选取GEO数据库中2个芯片数据集GSE93415和GSE99415,差异筛选条件为表达CMTM3表达上调或下调2倍及以上(Log2FC>1),同时P<0.05.采用microRNA靶基因在线预测软件Targetscan (http://www.targetscan.org/vert_72/)[11],预测CMTM3上游靶基因.

1.2.2 实时荧光定量PCR:根据说明书使用Trizol试剂(Invitrogen)从细胞中提取总RNA.分别用PrimeScriPt RT试剂盒和SYBR Prime-ScriPt-RT-PCR试剂盒进行逆转录(RT)和qRT-PCR.miR125b-5P和CMTM3使GAPDH作为内参照物.结果采用2-△△Ct法进行计算.CMTM3引物序列为:F:5’-TCTTGCGTGTGAATCTCTTACC-3’;R:5’-CAGGATCCACATTGGTGTTACC-3’.

1.2.3 MTT实验:培养分别于转染0、24、48、72 h后,弃去各孔培养基,PBS清洗3次,加入200 μL新鲜完全培养基,并加入5 mg/mL MTT溶液20 μL,继续将培养板置于37 ℃ 5%CO2培养箱中培养4 h,4 h后弃去上清,每孔加入150 μL DMSO,置摇床上低速振荡10 min,使结晶物充分溶解后,在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值,上机时设置调零孔.以时间梯度为横坐标(X轴),吸光值为纵坐标(Y轴)绘制曲线图.

1.2.4 划痕实验:取对数生长期的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,取六孔板,将事先处理好的细胞以50%的细胞密度均匀铺与六孔板内,置于37 ℃5%CO2孵箱中培养.24 h后将小干扰至细胞,并置于37 ℃5%CO2孵箱中培养.细胞转染24 h后,采用1000 μL枪头在贴壁细胞做垂直的划痕,然后弃掉培养基并用1×PBS清洗2遍后加入培养基后置于37 ℃ 5%CO2孵箱中培养.分别在上述细胞划痕后0、24、48 h后采用倒置显微镜观察细胞迁移情况,并随机记录3个视野下的细胞迁移距离.

1.2.5 双荧光素酶报告实验:培养GC MKN45细胞,将构建的miR-125b-5P mimics与PmiR-GLO-CMTM3-3’UTR共转染至MKN45细胞中,CMTM3基因的3’UTR区克隆至载体肾荧光素酶基因下游位点.构建结合miR-125b-5P mimics与对照的野生型(WT)报告质粒及突变型(MUT)报告质粒.采用LiPofectamine 3000试剂盒说明,转染构建好的质粒至MKN45细胞.转染48 h后,通过双荧光素酶报告检测系统进行检测.

图1 CMTM3基因在多种肿瘤及胃癌中的表达及其与患者预后关系.A:CMTM3在人体多种实体肿瘤中的表达情况(数据来源TCGA数据库);B:CMTM3在胃癌患者癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,数据来源TCGA数据库.T:癌组织.N:癌旁正常组织;C:随着胃癌分期的增高,CMTM3表达水平增高;D:CMTM3高表达患者总生存降低;E:CMTM3高表达患者无疾病进展生存降低;F:免疫组化显示胃癌组织中CMTM3高表达;G:正常胃组织中CMTM3低表达.

统计学处理相关统计分析采用R软件完成,计量资料用mean±SD表示,组间比较采用t检验,计数资料采用相对数表示,行χ2检验,双侧P<0.05为差别有统计学意义.

2 结果

图2 下调CMTM3表达后胃癌细胞的迁移和增殖能力减低.A:不同胃癌细胞系中CMTM3表达水平比较;B:针对CMTM3基因序列,合成3个针对CMTM3的小干扰RNA,转染细胞后判断其下调CMTM3基因mRNA表达情况;C:sh-CMTM3-1下调MKN45细胞系中CMTM3表达后,细胞迁移能力减低;D:sh-CMTM3-1下调MKN45细胞系中CMTM3表达后,细胞增殖能力减低.

2.1 CMTM3基因表达 TCGA数据库中,CMTM3基因mRNA在多种肿瘤及GC中的表达明显上调(图1A);在GC患者,癌组织中的CMTM3基因mRNA表达水平明显高于癌旁正常胃组织(图1B).同时,随着GC患者分期的升高,CMTM3基因表达水平也增加(图1C).预后分析数据来源于TCGA数据库,高低表达组患者各192例,随访时间130 mo,根据CMTM3基因mRNA表达水平分为高和低表达组(CMTM3表达水平≥中位数为高表达,反之为低表达),CMTM3基因高表达GC患者OS和DFS均低于低表达患者(图1D,E).免疫组化显示,CMTM3基因编码蛋白主要表达于细胞浆和细胞膜,在癌组织中高表达而在正常胃组织中低表达(图1F,G)

2.2CMTM3基因生物学功能CMTM3基因mRNA在不同GC细胞系中的表达水平明显高于正常胃上皮细胞(GES-1),且有统计学差异(P<0.05),MKN45GC细胞中CMTM3基因标的水平最高,图2A.外源性小干扰RNA(sh-CMTM3-1)可显著下调MKN45GC细胞中CMTM3基因表达(P<0.05),图2B.sh-CMTM3-1下调MKN45GC细胞中CMTM3基因表达后,细胞的迁移能力明显减低(P<0.05),图2C.MTT实验显示,sh-CMTM3-1下调CMTM3表达后,MKN45GC细胞增殖能力明显下降(P<0.05),图2D.

2.3 CMTM3上游靶基因预测 GEO数据库中下载GCvs正常胃黏膜差异表达芯片GSE93415和GSE99415,筛选出差异表达micro12个(图3A,B).同时采用miRNA靶基因下线预测软件,筛选出与上述12个差异表达基因重合的microRNA 3个,分别为miR-375,miR-125b-5P和miR-135b-5P(图3C,D).其中miR-125b-5P下调CMTM3基因在GC细胞中的表达最为明显(P<0.05)(图3E).

2.4 miR-125b-5P和CMTM3表达相关性 miR-125b-5P在正常胃粘膜细胞系中表达水平明显高于GC细胞系(P<0.05),图4A.GC患者癌组织中miR-125b-5P表达水平明显低于癌旁正常组织(P<0.05),图4B.CMTM3基因在GC组织中的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05),图4C.GC组织中CMTM3与miR-125b-5P表达呈负相关(rPearson=-0.58,P<0.05).MKN45细胞中,miR-125b-5P可显著下调CMTM3基因表达(P<0.05),图4E.荧光素报告酶实验显示miR-125b-5P基因与CMTM3基因3’UTR靶向结合,图4F.

2.5 miR-125b-5P下调CMTM3表达抑制GC细胞增殖和迁移 在GCMKN45细胞中,miR-125b-5P可显著下调CMTM3表达(P<0.05),图5A.MTT实验,下调CMTM3表达后GCMKN45细胞增殖能力明显减低(P<0.05),图5B.划痕实验显示,miR-125b-5P下调CMTM3表达后GCMKN45细胞迁移能力也明显下降(P<0.05),图5C.

3 讨论

图3 CMTM3上游靶基因预测.A:GSE93415胃癌差异表达microRNA火山图;B:GSE99415胃癌差异表达microRNA火山图;C:GSE93415、GSE99415数据集和Targetscan预测CMTM3上游靶基因的Venn图;D:筛选出的3个共差异表达micrRNA,分别为miR-375,miR-125b-5P和miR-135b-5P;E:miR-125b-5P下调CMTM3基因在胃癌细胞中的表达最为显著.

GC是临床上最常见的消化系统恶性肿瘤之一,也是癌症相关死亡的重要原因,在所有癌症死亡原因中排第三位置[12].尽管患者接受了外科手术或放化疗,GC患者的预后仍不理想,晚期患者远期生存率极低.晚期GC患者化疗及放疗效果十分有限,大多数患者仅能从放化疗中获益很少,其主要原因为其肿瘤细胞增殖、侵袭的分子机制未能完全明晰[4,13,14].因此,这里迫切需要更好地了解GC发生发展及增殖等生物学功能的分子机制及其相关信号通路.

CMTM3是趋化素样因子家族主要成员,在多种人体恶性肿瘤中呈现差异表达,并与细胞的恶性表型有关[15,16].已有研究显示CMTM家族蛋白在肿瘤生长、转移和抗肿瘤免疫中发挥重要作用[17,18].依据既往文献报道,CMTM不同家族成员在不同的肿瘤中的生物学功能并不完全相同,甚至在不同的肿瘤中呈现出相反的生物学功能[19].有文献报道,CMTM3在前列腺癌中表达水平较低,进一步下调细胞CMTM3表达水平后,其增长和侵袭能力增强,提示CMTM3在前列腺癌中可能发挥了抑癌基因的作用[20].然而在本研究中,我们通过生物信息学研究发现,CMTM3基因mRNA在大多数人体肿瘤组织中表达水平是上调的,提示其在人实体肿瘤的发生与发展中可能发挥重要作用.我们设计并合成了针对CMTM3的外源性小干扰RNA,转让GC细胞MKN45后,细胞的增殖和迁移能力减低,提示CMTM3在GC的增殖和迁移生物学功能方面具有重要作用.进一步我们对相关GC差异表达micorRNA基因芯片数据进行了分析,并结合microRNA靶基因在线预测软件证实了miR-125b-5P为CMTM3上游重要的靶基因,并能够下调CMTM3在GC细胞中的表达,并抑制细胞的增殖和迁移能力.

图4 胃癌细胞系及胃癌组织、正常胃组织中CMTM3、miR-125b-5P相对表达水平及相关性.A:miR-125b-5P在各胃癌细胞系中的表达;B:miR-125b-5P在胃癌和正常胃组织中的表达;C:CMTM3胃癌和正常胃组织中的表达;D:miR-125b-5P和CMTM3在胃癌组织中表达呈负相关;E:miR-125b-5P可显著下调MKN45胃癌细胞中CMTM3表达水平;F:荧光素报告酶实验显示miR-125b-5P基因与CMTM3基因3’UTR靶向结合.

图5 miR-125b-5P下调CMTM3表达抑制胃癌细胞增殖和迁移.A:miR-125b-5P可显著下调MKN45细胞中CMTM3表达;B:MTT实验下调CMTM3表达后胃癌MKN45细胞增殖能力明显减低;C:划痕实验显示miR-125b-5P下调CMTM3表达后胃癌MKN45细胞迁移能力明显下降.

CMTM3基因在GC组织及GC细胞株中高表达,并与GC患者的预后有关.时miR-125b-5P可靶向抑制CMTM3的表达,并影响MKN45 GC细胞的增殖和迁移.miR-125b-5P和CMTM3相关信号通路望成为GC预后的分子标志物和潜在治疗靶点.然而,CMTM3在不同肿瘤中的高低表达有差异,其大多数情况下作为抑癌基因发挥作用并在肿瘤组织中低表达.但CMTM3在不同肿瘤中也呈现高表达,可能作为癌基因发挥.因此,其确切分子机制并不完全清楚,在不同的肿瘤中可能发挥不同的作用.我们分析了TCGA数据库中的数据,显示期在GC中均为高表达.但由于CMTM3不同肿瘤组织中的表达水平存在差异,该基因在其他肿瘤中的作用及生物学功能有待进一步研究.

4 结论

miR-125b-5P靶向调控CMTM3基因表达影响GC增殖和迁移能力,并有望成为GC预后的分子标志物和潜在治疗靶点.

文章亮点

实验背景

胃癌(gastric cancer,GC)是临床常见消化系统恶性肿瘤,然而其发生发展及侵袭转移的确切分子机制仍不完全明晰.CMTM3是趋化素样因子家族主要成员,在多种人体恶性肿瘤中呈现差异表达,并与细胞的恶性表型有关.但其上游靶基因及其相关分子调控机制并不十分清楚.

实验动机

本研究目的在于采用生物信息分析结合细胞实验方法探讨CMTM3基因在GC中的表达、生物学功能及其潜在的分子调控机制,为后续靶向药物的研发提供新的潜在靶点.

实验目标

探寻CMTM3基因在GC细胞系及组织中的表达、及其对GC细胞增殖、迁移和穿膜能力的影响,同时探讨其潜在的分子调控机制.

实验方法

生物信息法分析CMTM3基因的差异表达情况,并比较CMTM3基因在上皮细胞和多个GC细胞系中表达情况.在GC细胞中转染外源性小干扰下调细胞中CMTM3基因表达后评价细胞增殖和迁移能力.预测CMTM3上游靶基因,双荧光素酶报告实验验证miR-125b-5P与CMTM3靶向调控关系.转染外源性miR-125b-5P-mimic,评价GC细胞增殖和迁移能力的变化.

实验结果

GC组织中的CMTM3基因mRNA表达水平明显高于癌旁正常胃组织(P<0.05),并于预后有关.miR-125b-5p可显著下调GC细胞CMTM3表达,并影响细胞的增殖和迁移能力(P<0.05).

实验结论

miR-125b-5p靶向调控CMTM3基因表达影响GC增殖和迁移能力,并有望成为GC预后的分子标志物和潜在治疗靶点.

展望前景

miR-125b-5p靶向抑制CMTM3基因的表达,并影响GC患者的预后,有望成为GC靶向药物开发的新靶点及信号通路.