思连康联合艾司奥美拉唑钠治疗幽门螺杆菌相关性胃炎疗效及对NF-κB炎症信号通路的影响

黄龙武,李 雷

黄龙武,李雷,湖州市第三人民医院内镜中心 浙江省湖州市 313000

0 引言

慢性胃炎是由饮食、环境及自身免疫等多种致病因素引起的慢性胃黏膜炎性病变,为常见病、多发病[1].幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)是一种S形、微需氧的革兰阴性菌,根据《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》[2]指出其是慢性活动性胃炎的主要致病菌之一,同时2015年京都会议总结得出H.pylori感染对患者临床症状具有重要影响[3].但是,并非所有患者经根除H.pylori后消化不良症状(主要指中上腹症状,诸如上腹痛、上腹不适)均可得到改善,研究发现仅有60%的患者对此完全应答[4].对于根除H.pylori的治疗,铋剂四联方案作为经验性治疗的一线方案得到了普及和推广,但随着抗生素耐药率逐年升高,此方案势必出现疗效降低趋势,再加之部分患者可能因消化不良症状而反复就诊,造成资源浪费[5].因此,寻找杀灭H.pylori的新型制剂或改变应对策略仍然是值得深入研究的重点.在抗H.pylori治疗方案中,阿莫西林一直是抗生素的首选,而质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,PPI)是所有抗H.pylori感染治疗方案中的必用药物,因此于上世纪80年代末有学者首次提出PPI和阿莫西林的二联疗法,且取得满意效果[6].艾司奥美拉唑是奥美拉唑的S异构体,已获得临床路径及多个指南/共识的一致推荐,在保护胃黏膜方面具有显著效应[7].近年来,思连康被广泛应用在诸多胃肠疾病的辅助治疗中,亦取得了显著临床疗效.药理研究显示[8],思连康中的有益菌可通过肠壁上的磷壁酸黏附并大量繁殖形成“菌膜”结构,形成肠菌群生物屏障,减少细菌和内毒素吸收,增强肠黏膜抵抗力.基于上述认识,本课题组在结合前期研究基础上,我们观察了思连康联合优化二联疗法治疗H.pylori相关性胃炎患者的治疗效果及可能机制,以期判断其应用价值,为临床提供一线资料.

1 材料和方法

1.1 材料 选取2018-11/2019-12于我院接受治疗的H.pylori相关性胃炎患者64例临床资料,所有受试者均符合2015年日本京都会议有关H.pylori相关性胃炎共识的诊断标准[3].纳入标准:(1)胃镜检查提示胃炎,可伴糜烂、萎缩、肠化、异型增生;(2)就诊前4 wk内未服用过、抗生素、糖皮质激素、非甾体类抗炎药;(3)具有上腹不适症状(疼痛或饱胀不适),持续时间为1 mo以上;(4)快速尿素酶试验或14C-尿素呼气试验提示H.pylori阳性;(5)患者及其家属同意且签署知情同意书.

排除标准:(1)胃镜检查提示消化性溃疡、肿瘤等;(2)具有重叠综合征者,如合并肠易激综合征或胃食管反流病等;(3)具有心、肝、肾等器质性疾病;(4)过敏体质或对本研究试验药物组成成分过敏者;(5)具有精神疾病,不能决定自己意愿者.按照随机数字表法将纳入对象分为治疗组(32例)与对照组(32例),基线资料分布如下:治疗组男18例,女14例;年龄23-70岁,平均年龄46.40岁±5.23岁;病程11.79 mo-8.38年,平均病程3.17年±0.49年;对照组男17例,女15例;年龄24-72岁,平均年龄46.58岁±5.31岁;病程9.28 mo-11.37年,平均病程3.29年±0.60年.两组研究对象基线资料组间无显著性差异,具有可比性.本研究由湖州市第三人民医院医学伦理委员会审核批准(批件号:2020-076).

1.2 方法 所有受试者均予以共识首推的疗法,即为艾司奥美拉唑钠肠溶片(重庆莱美药业股份有限公司;国药准字:H20 130095;规格:20 mg/片)20 mg,bid,早、晚餐前30 min服用;阿莫西林胶囊(白云山东泰商丘药业有限公司;国药准字:H20 003350;规格:0.25 g/粒)1000 mg,bid,早、晚餐前30 min服用.疗程为14 d.

在此基础上,治疗组给予双歧杆菌四联活菌片(杭州远大生物制药有限公司;国药准字:S20 060010;规格:0.5 g/片)1500 mg,3次/d,双歧杆菌四联活菌片与抗生素服药时间间隔2-3 h.疗程为14 d.

于治疗前后,胃镜下取胃黏膜进行病理活检及免疫组化,以检测IL-1β、IL-8、TNF-α,同时采用荧光定量PCR法检测NF-κB P50、P65 mRNA,并用BCA法进行NF-κB P50、P65蛋白定量.

1.3 观察指标 分别于治疗前后胃镜下取胃黏膜组织经碾磨、裂解、超声后离心取上清,采用实时定量荧光PCR法检测NF-κB P50、P65 mRNA表达,即应用Trizol提取上清中的总RNA,在CFX96实时荧光定量PCR仪(美国伯乐BIO-RAD公司产品)上,并参照试剂盒说明书逆转录为cDNA.为消除加样误差,每个标本设3个重复管,以β-actin为内对照,并用同一样品的cDNA和同样的PCR反应条件进行扩增,计算所有标本NF-κB P50、P65 mRNA及β-actin 3个重复孔的平均Ct值.以Primer软件设计引物,目的基因mRNA相对表达水平为2-△△Ct.△△Ct目的基因=每个标本的目的基因Ct值-此标本的内参基因Ct值,引物序列见表1.

于治疗前后,同上述方法制备上清,用BCA试剂盒(英国Abcam公司产品)测定蛋白浓度,SDA-PAGE垂直电泳分离,上样量为30 μg/孔,转移蛋白质至PVDF膜,10%脱脂奶粉(TTBS配制)的封闭液中,4 ℃封闭过夜.分别加入抗体稀释液为5%脱脂奶粉的NF-κB P50、P65单克隆抗体(英国Abcam公司产品)孵育,室温孵育4 h,用TTBS洗涤,然后加入1:3000稀释的辣根过氧化物酶标记的抗鼠或抗兔的二抗室温孵育1 h,用TTBS洗涤.显色,使用Gel-protein软件对条带进行半定量分析,测出各条带IOD值.

表1 Real time-PCR引物序列及扩增产物长度

于治疗前后收集外周血2 mL后低速离心后留取清液,使用酶联免疫吸附法对血清IL-1β、IL-8、TNF-α水平进行测量.

由专职医师操作,采用上海维世康医用电子有限公司生产的ESE-360型胃镜,分别于治疗前和治疗结束后1 mo,观察所有受试者胃黏膜充血、水肿、糜烂、出血点情况.

根据胃镜检查结果及14C呼气试验结果进行疗效判定[9],具体分为:以14C呼气试验转阴,胃镜下示黏膜恢复正常者为治愈;以14C呼气试验转阴,胃镜下病变黏膜范围较前减少2/3者为显效;以14C呼气试验阳性,胃镜下病变黏膜范围较前减少1/2者为有效;以,14C呼气试验阳性,胃镜下病变黏膜范围未较前缓解1/2者为无效.治愈、显效、有效三者合计为有效,据此计算有效率.

记录两组患者治疗期间所出现的药物相关不良反应,并于治疗结束后1 mo采用YH04AS型H.pylori检测仪(购自安徽养和医疗器械设备有限公司)进行14C尿素呼气实验,以评估H.pylori根除情况,根除率=H.pylori转阴例数/总人数×100%.

统计学处理利用SPSS 20.0软件分析,计量资料经正态性检验符合正态性分布,在文字叙述时平均数±标准差表示为mean±SD.进行两两比较时采用Dunnet-t检验,组间各指标比较采用单因素方差分析.计数资料采用率(%)表示,应用χ2检验分析,P<0.05提示差异具有统计学意义.

2 结果

2.1 两组NF-κB P50、P65 mRNA和蛋白表达比较 治疗前两组NF-κB P50、P65 mRNA和蛋白比较均无统计学意义(1.95±0.46vs1.98±0.49,1.70±0.40vs1.66±0.38,3.28±0.70vs3.35±0.68,2.96±0.64vs3.03±0.59);治疗后,两组NF-κB P50、P65 mRNA和蛋白均呈下降趋势,同时治疗组较对照组更低(1.42±0.33vs1.10±0.24,1.27±0.26vs0.87±0.17,2.51±0.52vs1.94±0.28,2.33±0.37vs1.77±0.23)(P<0.01),见图1.

2.2 两组炎症反应指标比较 治疗前,两组IL-1β、IL-8、TNF-α比较均无统计学意义(19.29±4.40vs19.71±4.18,356.41±39.61vs354.52±39.70,30.62±4.40vs29.88±4.49);治疗后,两组IL-1β、IL-8、TNF-α均呈下降趋势,同时治疗组较对照组更低(11.50±3.40vs7.30±2.16,237.70±27.72vs193.68±19.88,19.30±3.41vs10.87±2.18)(P<0.01),见图2.

2.3 两组胃镜下黏膜情况比较 治疗组胃黏膜充血、水肿、糜烂和出血点好转例数均明显多于对照组,组间比较具有统计学意义(P<0.05),见图3.

2.4 两组临床疗效比较 治疗组治愈、显效、有效、无效分别为8例、10例、13例、1例,其治疗总有效率为96.88%,而对照组分别为4例、9例、12例、7例,治疗总有效率为78.13%,治疗组显著高于对照组(χ2=5.14,P=0.02),见图4.

2.5 两组H.pylori根除率比较 治疗组H.pylori根除率高于对照组(93.75%vs75.00%),差异有统计学意义(χ2=4.27,P=0.04).

2.6 两组不良反应比较 64受试者全部完成试验,且所有患者未曾出现严重不良反应.

3 讨论

第五次全国幽门螺杆菌感染共识亦提出将H.pylori相关性胃炎作为一种独立的疾病,建议H.pylori感染者即便无消化不良症状亦应根除H.pylori[10].目前临床中多采用含铋剂的四联杀菌方法,其在中国的根除率可达85%-94%[11].但这种方案临床疗效仍不尽如人意,铋剂、四环素、呋喃唑酮等药物在某些地区不可获得,且四联疗法中需口服两种广谱抗生素,在推荐用于根除治疗的6种抗菌药物中,部分患者存在不同程度的双重、三重、甚至四重耐药,再加之我国H.pylori感染人口基数量大,H.pylori菌株的变异及抗生素滥用等因素的影响,传统治疗H.pylori方法受到挑战[12].因此,寻求安全、高效的抗H.pylori方案已成为国内外学者研究的热点.

图1 两组NF-κB P50、P65 mRNA和蛋白表达比较.A:两组NF-κB P50 mRNA水平的比较;B:两组NF-κB P50蛋白水平的比较;C:两组NF-κB P65 mRNA水平的比较;D:两组NF-κB P65蛋白水平的比较.NF-κB P50:核因子κB P50;NF-κB P65:核因子κB P65.

图2 两组炎症反应指标比较.A:两组IL-1β水平的比较;B:两组IL-8水平的比较;C:两组TNF-α水平的比较.IL-1β:白细胞介素-1β;IL-8:白细胞介素-8;TNF-α:肿瘤坏死因子-α.

在既往研究报道中,二联疗法的临床价值可能被低估,现阶段除了美国胃肠病学院(ACG)2017年临床指南[13]中提到二联疗法可以用于首次标准三联疗法根除H.pylori失败的补救治疗,其他共识如中国H.pylori共识[14]、多伦多共识[15],均未提及二联疗法.韦丽秋等[16]进行一项单中心、开放、随机对照的非劣效性研究,发现基于药理学和药物遗传学的优化的PPI-阿莫西林二联疗法不仅与含铋剂的四联杀菌方法疗效相当,依从性好,安全性好且不良反应更少.近年来益生菌在辅助抗H.pylori治疗中的作用也日益受到临床关注,其中思连康是一种对宿主有益的口服四联活菌制剂,制剂中的双歧杆菌、乳酸菌等能与肠黏膜上皮表面特异性受体结合,拮抗致病菌的生长,恢复胃内微生物生态平衡,有利于有害菌、毒素等物质排出体外[17].目前有关思连康联合优化二联疗法治疗H.pylori相关性胃炎的相关研究临床涉及较少,为了给后续同类患者的诊疗奠定实践基础,本文在下文中进一步从治疗效果及可能作用机制展开论述.

图3 两组胃镜下黏膜情况比较.不同字母间比较具有统计学意义,P＜0.05.

图4 两组临床疗效比较.不同字母间比较具有统计学意义,P＜0.05.

本课题组经过临床观察发现:治疗组较对照组在H.pylori改善根除率及胃镜下黏膜情况等方面均具有优势,且前者在整体治疗效果方面更具有优势,笔者分析原因可能是思连康能够通过免疫调节及信号通路调节等多条途径改善H.pylori相关性胃炎,但仍需进一步扩大样本量进行验证.近年来诸多研究学者从不同角度分析了H.pylori相关性胃炎的发病机制,多数认为NF-κB信号通路的激活在该病的发生发展中起到重要作用[18,19].魏茜等[20]就对H.pylori感染后NF-κB具体活化及调控机制进行了阐明,其结果显示H.pylori感染相关胃粘膜癌变早期NF-κB信号通路异常活化,可能参与了胃黏膜癌变过程.陈新怡等[21]的研究亦表明,NF-κB信号通路与药物治疗H.pylori相关性消化疾病密切相关.据相关研究表明[22],NF-κB介导的信号通路是应激和炎症反应的调节中枢,不仅可维持机体内环境的稳定,又可介导病原特异性应答,其家族成员包括c-Rel、RelB、P65、P50、P52.正常生理条件下,NF-κB在细胞浆中以P50/P65二聚体形式存在,这一异源二聚体亦是其发挥生物学功能的主要形式,可与其抑制蛋白IκB结合,滞留于细胞浆中且无转录活性[23].当病毒或细菌等外界刺激因素作用于细胞后,局部组织内炎症介质含量增多,可导致NF-κB的激活,而源于炎症反应激活的NF-κB可使得炎症持续和放大,从而引起H.pylori胃炎,同时二者又可反馈激活IκB激酶复合物IKKs,后者可磷酸化IκB氨基末端的2个丝氨酸残基(Ser32、Ser36),IκB蛋白从三聚体解离下来,使P50及P65暴露,继而NF-κB被释放并转移至细胞核内与目的基因结合,启动TNF-α、IL-8、IL-1β、Bcl-2等靶基因转录[24].Feige等[25]通过H.pylori感染胃上皮细胞发现NF-κB下游炎症相关因子如TNF-α、IL-8、IL-1β水平随病情进展不断升高,形成“瀑布样效应”,加重胃黏膜组织损伤,进一步表明NF-κB信号通路参与H.pylori感染过程.本研究通过进一步研究发现,思连康联合优化二联疗法能够显著抑制NF-κB信号通路的活化且下调其下游炎症因子的表达,这可能也是该方案改善H.pylori相关性胃炎患者临床症状的重要因素之一.分析原因可能为思连康可使益生菌在肠道内定植、生长及繁殖,以维持肠道正常结构及生理功能,进一步增加巨噬细胞的活性、杀伤性细胞及T细胞的数量,从而显著改善机体免疫机制失衡以及促炎因子/抗炎因子失衡.

4 结论

综上所述,思连康联合优化二联疗法治疗可显著缓解H.pylori相关性胃炎症状,疗效显著,其机制可能与抑制NF-κB炎症信号通路的活化及炎性因子释放有关.但是,本研究也有一定的局限性,如医院条件有限使得样本量不够充足,未对观察指标进行动态观察,这些都可能是结果的潜在影响因素,因此,我们下一步的工作方向是大力提升实验室检测能力,扩大样本量行分层分析,以期对本文实验结果进行进一步的论证与支持.

文章亮点

实验背景

当前,幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)感染的治疗,面临着耐药率高、根除率低的困境,14 d的铋剂四联疗法作为经验治疗的首选方案,仍存在药物相关的副作用较多、方案较复杂、服药依从性差、药物成本较高等局限性,因此探索一种根除率高、副作用较小、依从性较好的治疗H.pylori相关性胃炎的方案成为临床急需解决的问题.

实验动机

本研究为临床治疗H.pylori相关性胃炎提供一种新的方案,即在质子泵抑制剂(proton pump inhibitors,PPI)和阿莫西林的二联疗法基础上,加用益生菌进行治疗,同时研究结果也为临床探讨这一方案的治疗效果以及其可能作用机制提供了重要数据参考.

实验目标

探究思连康联合优化二联疗法治疗H.pylori相关性胃炎的治疗效果及对NF-κB炎症信号通路的影响.

实验方法

前瞻性的选取符合入选标准H.pylori相关性胃炎患者,并采用随机数字表法分为两组,比较两组临床疗效、胃黏膜改变情况、H.pylori根除率及药物相关不良反应情况,同时测定两组治疗前后的IL-1β、IL-8、TNF-α以及NF-κB P50、P65 mRNA和蛋白水平.

实验结果

思连康联合优化二联疗法治疗可显著缓解H.pylori相关性胃炎症状,疗效显著,其机制可能与抑制NF-κB炎症信号通路的活化及炎性因子释放有关.

实验结论

结合前人经验,艾司奥美拉唑+阿莫西林可作为根除H.pylori的经验性治疗的一线方案,本研究提出在此优化二联疗法基础上加用思连康治疗H.pylori相关性胃炎,不仅证实了此方案治疗效果确切高效,且分析了其可能作用机制,治疗H.pylori相关性胃炎提供了新的策略,部分解决了目前一线治疗方案的不足,尽可能避免了继发性耐药.

展望前景

我们下一步的工作方向可能分为几个方面:(1)确定二联疗法联合益生菌中每种药物的最佳剂量、给药频率以及疗程,以达到最大疗效,制定最优方案;(2)优化二联疗法中PPI的选择,可以根据患者的CYP2C19基因或其他基因的不同基因型,而个体化定制;(3)可以使用新型制酸剂沃诺拉赞,在二联疗法中替代传统PPI用于治疗H.pylori;(4)进行多中心研究,扩大样本量,减少偏倚.