miR-10a-5p敲低通过靶向THBS2抑制胃癌细胞的生长和转移

任玲玲, 王立明, 朱雅碧

任玲玲, 王立明, 朱雅碧, 丽水市人民医院消化内科 浙江省丽水市323000

核心提要：miR-10a-5p在胃癌中高表达.miR-10a-5p敲低通过靶向THBS2抑制MGC-803和AGS细胞的增殖, 集落形成, 迁移和侵袭.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)是一种常见的消化肿瘤[1].近年来我国GC的发病率呈增高趋势[2].探索GC的进展机制对于开发新的治疗方法至关重要.miRNA是短的(约19-24 nt)非编码单链RNA, 可通过调节其靶基因参与多种生物过程, 如增殖, 分化, 凋亡, 发育, 血管生成和免疫应答[3,4].目前, miRNA在肿瘤进展中的作用也得到了广泛的研究, 如, miR-10b和miR-126分别通过调节同源盒蛋白b3(Homeobox b3, HOXB3)和sry相关HMG盒蛋白2(sry-related HMG box 2, Sox2)表达来控制子宫内膜癌和肝细胞癌的细胞凋亡, 增殖, 迁移和侵袭[5,6].据报道[7,8], miR-137, miR-421, miR-337-3p和miR-1等许多miRNAs可调节GC的发展.因此, 发现调节GC细胞生长和转移能力的miRNAs是至关重要的, 这将为治疗该疾病提供有价值的靶标.有文献[9,10]发现, 肝癌组织和肝癌细胞中miR-10a-5p高表达, 在肝癌细胞中过表达miR-10a-5p可影响肝癌细胞增殖与迁移.而miR-10a-5p在GC中作用报道尚少.

因此, 本研究旨在探讨miR-10a-5p在GC中的表达以及其对GC细胞生长和转移的影响及其分子机制, 期望基于miR-10a-5p功能极其分子机制能为GC的治疗提供有用的线索.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂：胎牛血清(FBS), Opti-MEM培养基(Gibco公司, 美国)； RPMI-1640培养基, Lipofectamine 2000试剂和SYBER绿色探针(Invitrogen公司, 美国)；Trizol试剂(Sigma公司, 美国)； AMV逆转录酶(TaKaRa公司, 日本)； 血小板反应蛋白2(thrombospondin 2,THBS2)抗体和GAPDH抗体(Santa Cruz公司, 美国)；miR-10a-5p抑制剂(miR-10a-5p inhibitor), miRNA阴性对照(NC), 人THBS2全长cDNA序列和对照乱码序列(上海吉凯基因公司)； CCK-8试剂盒, RIPA裂解缓冲液,BCA蛋白质测定试剂盒和ECL化学发光试剂(上海碧云天生物技术公司)； 快速点定向突变试剂盒(Agilent公司, 美国)； 双荧光素酶报告分析试剂盒(Promega公司, 美国).

1.1.2 人GC组织和细胞系：在浙江省丽水市人民医院随机选取10例接受GC切除术的GC患者, 所有患者均提供书面同意, 本研究的各个方面均经过医院伦理委员会批准(No.201812006).收集GC组织和癌旁正常组织, 将组织储存在-80 ℃备用.人正常胃上皮细胞(GES)和GC细胞(MGC-803和AGS)购自中国科学院上海细胞生物学研究所.将细胞在补充有10%FBS的RPMI-1640培养基中在5%CO2的细胞培养箱中培养.

1.2 方法

1.2.1 miR-10a-5p-inhibitor转染：将GC细胞(MGC-803和AGS)接种在6孔板中, 用补充有10%FBS的RPMI-1640培养基培养, 当细胞约60%-70%汇合时, 更换无血清Opti-MEM培养基培养6 h, 用Lipofectamine 2000试剂分别将miR-10a-5p inhibitor和NC转染入细胞.6 h后, 更换为补充有10% FBS的RPMI-1640培养基, 继续培养48 h后, 收集细胞.

1.2.2 共转染细胞系构建：将人全长THBS2 cDNA序列和乱码序列克隆入pcDNA3.1质粒, 并分别构建pcDNATHBS2和pcDNA-Con质粒.使用Lipofectamine 2000试剂分别将NC+pcDNA-Con, miR-10a-5p inhibitor+pcDNACon和miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-THBS2共转染入MGC-803细胞.

1.2.3 RNA提取和RT-qPCR：使用Trizol试剂分别从GC组织, 癌旁组织, GES细胞, MGC-803细胞和AGS细胞中提取总RNA.使用光度计(Eppendorf, 德国)测定总RNA浓度.使用oligo dT和AMV逆转录酶在反应中将1 μg总RNA逆转录成cDNA.SYBER绿色探针和miR-10a-5p, THBS2和GAPDH的特异性引物和cDNA使用Applied Biosystems 7300检测系统进行实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)反应.反应条件为95 ℃温育5 min, 然后进行40个循环：95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s.引物的序列：miR-10a-5p F：5’-CGCTACCCTGTAGATCCGAA-3’,R：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’； THBS2 F：5’-GGGGACACTTTGGACCTCAAC-3’, R：5’-GCAGC CCACATACAGGCTA-3’； GAPDH F：5’-ACAACTTTG GTATCGTGGAAGG-3’, R：5’-GCCATCACGCCACAG TTTC-3’； U6 F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’, R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’.使用2-△△CT法计算miR-10a-5p相对于内部对照U6的表达量和THBS2 mRNA的相对于内部对照GAPDH mRNA的表达量.实验一式三份独立进行.

1.2.4 细胞增殖测定：将仅转染miR-10a-inhibitor或NC的MGC-803或AGS细胞和共转染的 MGC-803细胞接种到96孔板, 每孔接种5000个细胞, 继续培养24和48 h.每孔添加10 μL CCK-8检测试剂, 孵育2 h后, 用酶标仪检测(波长450 nm)吸光度.实验一式三份独立进行.

1.2.5 集落形成测定：将仅转染miR-10a-5p inhibitor或NC的MGC-803或AGS细胞和共转染的MGC-803细胞接种到24孔板中并孵育12 d后, 用4%多聚甲醛固定细胞并用结晶紫染色, 对集落进行计数并拍照.实验一式三份独立进行.

1.2.6 细胞迁移与侵袭测定：使用Transwell法检测细胞的迁移与侵袭.收集仅转染miR-10a-5p inhibitor或NC的MGC-803或AGS细胞和共转染的MGC-803细胞, 用无血清的RPMI-1640培养基制备单细胞悬浮液.将100 μL细胞悬浮液以5×105细胞/mL的密度接种到Transwell的上室(matrigel基质胶包被滤膜用于侵袭测定； 仅滤膜用于迁移测定)中, 将500 μL含补充有10% FBS的RPMI-1640培养基加入底室.孵育24后, 用PBS除去未通过滤膜的细胞, 用95%乙醇固定5 min, 结晶紫染色.在显微镜(200×)下对细胞计数并拍照.实验一式三份独立进行.

1.2.7 蛋白提取和Western blot：使用RIPA裂解缓冲液从GC组织, 癌旁组织, GES细胞, MGC-803细胞, AGS细胞和已转染的细胞中提取总蛋白.通过10%SDS-PAGE分离蛋白并转至PVDF膜.在室温下用5%脱脂乳封闭1 h后, 将膜用一抗(THBS2和GAPDH)在4 ℃下免疫反应过夜, 在TBST中洗涤三次, 然后在室温下与二抗孵育1 h.用增强的化学发光试剂检测条带信号.使用Image J软件量化每个条带的强度.通过用GAPDH标准化THBS2蛋白的相对表达.

1.2.8 荧光素酶活性测定：TargetScan在线软件预测的与miR-10a-5p具有结合效应的THBS2 3’UTR区域, 根据快速点定向突变试剂盒说明书步骤, 对该区域进行进行点突变, 并将THBS2 3’UTR点突变后的序列克隆至萤火虫荧光素酶基因的上游, 构建pGL3-Mut-THBS2 3’UTR荧光素酶报告质粒.用同样的方法, 将野生型THBS2的序列构建pGL3-WT-THBS2 3’UTR荧光素酶报告质粒.用Lipofectamine 2000试剂将miR-10a-5p inhibitor, NC, WTTHBS2 3’UTR, Mut-THBS2 3’UTR和海肾荧光素酶基因(phRL-TK)质粒共转染到MGC-803细胞中.转染48 h后,通过双荧光素酶报告分析试剂盒分析荧光素酶活性.

统计学处理本实验数据用mean±SD表示, 采用SPSS 18.0软件将实验中所得的数据进行统计分析.多组之间比较采用单因素方差分析.以P＜0.05为界定差异有统计学意义.

2 结果

2.1 miR-10a-5p在GC组织和GC细胞中表达情况 如图1A显示, 与癌旁正常组织相比, miR-10a-5p在GC中的表达显著上调(P＜0.05).在细胞中(图1B), 与GES细胞比较,miR-10a-5p在GC细胞(MGC-803和AGS)中也显著上调(P＜0.05).

2.2 miR-10a-5p对GC细胞增殖, 集落形成, 迁移和侵袭的影响 将miR-10a-5p-inhibitor转染到GC细胞(MGC-803和AGS)中, 抑制细胞中miR-10a-5p的表达(图2)后, 检测miR-10a-5p敲低后细胞的增殖, 集落形成, 迁移和侵袭,结果显示, 相对于NC组, 转染 miR-10a-5p-inhibitor组中细胞的增殖(图3A、B), 集落数(图3C、D), 迁移细胞数(图3E、F)和侵袭细胞数(图3G、H)均显著降低(P＜0.05或P＜0.01).

2.3 mi-10a-5p与THBS2基因的靶点验证 在组织中, 相对于癌旁正常组织, GC组织中THBS2的蛋白和mRNA的表达水平均显著降低(P＜0.05)(图4A、B).在细胞中,相对于GES细胞, MGC-803细胞和AGS细胞中THBS2的蛋白和mRNA的表达水平也降低(P＜0.05)(图4C、D).TargetScan在线软件结果显示, THBS2 3’UTR预测存在miR-10a-5p的结合序列(图4E)； 双荧光素酶报告基因检测结果显示(图4F), 在WT组中, miR-10a-5p inhibitor组的THBS2相对荧光素酶活性较NC组显著增加(P＜0.05)； 而Mut组中, 两组的THBS2相对荧光素酶活性无统计学意义, 证明 THBS2是miR-10a-5p的靶基因.结果显示, 相对于NC组, miR-10a-5p inhibitor组THBS2蛋白和mRNA水平均显著增加(P＜0.05)(图4G、H).综上所述, 在人GC细胞系中, THBS2是miR-10a-5p的靶基因.

2.4 miR-10a-5p通过靶向THBS2影响MGC-803细胞的增殖, 集落形成, 迁移和侵袭 将miRNA-10a-5p inhibitor和pcDNA-THBS2共转入MGC-803细胞, 检测过表达THBS2(图5A、B)对已转染miR-10a-5p inhibitor细胞的增殖, 集落形成, 迁移和侵袭的影响, 结果显示, 相对于转染miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-Con组, 转染miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-THBS2组中细胞的增殖(图5C), 集落数(图5D、E), 迁移细胞数和侵袭细胞数(图5F-H)均显著增加(P＜0.05或P＜0.01), 说明miR-10a-5p敲低通过靶向THBS2抑制人GC细胞的生长和转移.

3 讨论

GC是全球癌症相关死亡的主要原因, 由于缺乏特异性和敏感性的生物标志物, 总体5年生存率低于20%[11,12].因此, 对GC患者迫切需要一种可靠有效的治疗方法.

文献[13]报道, 在人体中约30%的基因表达受miRNAs控制, 广泛地参与细胞发育和生理过程.miRNAs的表达经常在肿瘤中失调[14,15].此外, miRNAs在肿瘤的诊断和治疗中均发挥了举足轻重的作用[16,17].其中, miR-10a-5p可影响肝癌[9]和乳头状甲状腺癌[18]等癌症的进展.miR-10a-5p可通过丝裂原活化蛋白激酶8相互作用蛋白1(mitogen-activated protein kinase 8 interacting protein 1, MAPK8IP1)促进GC转移[19].而miRNA的作用是多样的, 机制也是复杂的, 因此, miR-10a-5p在GC中的具体作用和机制仍需进一步鉴定.在本研究中, 我们采用RT-qPCR检测了GC组织和GC细胞中miR-10a-5p的表达情况, 结果显示, miR-10a-5p在GC组织和GC细胞系中表达均显著上调.接下来, 我们将miR-10a-5p-inhibitor转染入GC细胞MGC-803和AGS中, 结果显示, 敲低miR-10a-5p能抑制 MGC-803和AGS细胞的增殖, 集落形成,迁移与侵袭.

miRNAs可通过靶基因发挥后续生物学作用[20].我们采用TargetScan在线软件筛选出THBS2为miR-10a-5p的潜在靶点之一.THBS2是基质细胞Ca2+结合糖蛋白家族的成员之一, 发现其与多种细胞受体, 生长因子和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白相互作用, 从而导致其在细胞粘附, 增殖和细胞凋亡中发挥功能[21].THBS2在肿瘤中的表达与血管分布, 进展和转移的减少有关[22].有研究[23]发现, THBS2水平较高的GC患者预后较好, 而THBS2表达减少与较差的GC组织学分级和预后不良相关.然而, 很少有研究探讨GC中miR-10a-5p与THBS2的关系.我们采用双荧光素酶基因证明了THBS2是miR-10a-5p的靶基因.THBS2高表达有助于GC的进展[23].在本实验中, 敲低miR-10a-5p能促进THBS2表达；我们进一步将miR-10a-5p inhibitor和THBS2共转染入MGC-803细胞, 结果显示, 转染THBS2后逆转了miR-10a-5p敲低对MGC-803细胞的增殖, 集落形成, 迁移与侵袭的抑制作用.总之, 我们的数据进一步表明在GC中THBS2是miR-10a-5p的功能靶标.

本研究依然存在不足之处：比如收集的临床样本量相对少, 造成无法分析miR-10a-5p与GC临床特征(临床分期、肿瘤分化、肿瘤大小、肿瘤位置和是否淋巴结转移)的关系； THBS2下游与GC细胞生长与转移相关的具体信号通路尚未明了.这些未知的研究方向值得我们后期持续研究.

图1 miR-10a-5p在GC组织和GC细胞中表达增加.A：miR-10a-5p在癌旁正常组织和GC组织中表达水平, 与癌旁正常组织相比, aP＜0.05, n =10； B：miR-10a-5p在正常胃上皮细胞GES和GC细胞MGC-803和AGS中表达水平, 与GES细胞相比, cP＜0.05, n = 3.GN：癌旁正常组织； GC：胃癌.

图2 在胃癌细胞MGC-803和AGS中, miR-10a-5p inhibitor的转染效率鉴定.A：MGC-803细胞中； B：AGS细胞中.与NC组相比, aP＜0.05, n = 3.

图3 miR-10a-5p敲低抑制胃癌细胞增殖, 集落形成, 侵袭和侵袭.A, B：CCK-8法检测MGC-803细胞(A)和AGS细胞(B)的细胞活性, 与NC组相比, aP＜0.05, bP＜0.01, n = 3； C, D：集落形成实验检测MGC-803细胞和AGS细胞的集落形成, 与NC组相比, cP＜0.05, n = 3； E、F：Transwell法检测MGC-803细胞和AGS细胞的迁移能力, 与NC组相比, eP＜0.05, n = 3； G、H：Transwell法检测MGC-803细胞和AGS细胞的侵袭能力, 与NC组相比, gP＜0.05, n = 3.

图4 THBS2是miR-10a-5p的靶基因.A：Western blot法检测GN和GC组织中THBS2蛋白表达； B：RT-qPCR法检测GN和GC组织中THBS2 mRNA表达, 与癌旁正常组织相比, aP＜0.05, n = 10； C：Western blot法检测GES, MGC-803和AGS细胞中THBS2蛋白表达； D：RT-qPCR法检测GES, MGC-803和AGS细胞中THBS2 mRNA表达, 与GES细胞相比, cP＜0.05, n = 3； E：TargetScan软件预测的THBS2 3’UTR与miR-10a-5p结合序列(红色)和点突变序列(下)； F：双荧光素酶基因法THBS2相对荧光酶活性, 与NC组相比, eP＜0.05, n = 3； G：Western blot法检测敲低miR-10a-5p的MGC-803细胞中THBS2蛋白表达； H：RT-qPCR法检测敲低miR-10a-5p的MGC-803细胞中THBS2 mRNA表达, 与NC组相比, gP＜0.05, n = 3.RT-qPCR：实时荧光定量PCR； GC：胃癌.

综上所述, 我们目前的结果显示, 敲低miR-10a-5p通过上调靶基因THBS2表达来发挥抑制GC细胞生长和转移的能力, miR-10a-5p可能是治疗GC的潜在靶点.

文章亮点

实验背景

我国胃癌(gastric cancer, GC)的发病率呈逐年增加趋势和低龄化趋势.而筛选影响GC进展的生物学靶点, 有助于对GC治疗方法开发提供线索.miRNAs在GC的发病和进展中发挥重要作用.

实验动机

miR-10a-5p在肝癌组织高表达, 且其可促进肝癌细胞增殖与转移, 而miR-10a-5p对GC细胞增殖, 克隆集落形成,迁移与侵袭的作用尚不清楚.

实验目标

本研究旨在检测miR-10a-5p在GC组织和GC细胞的表达, 并探索miR-10a-5p对GC细胞增殖, 克隆集落形成, 迁移与侵袭的影响, 并分析其中的机制.

图5 过表达THBS2逆转miR-10a-5p敲低对MGC-803细胞增殖, 集落形成, 迁移与侵袭的抑制作用.miR-10a-5p inhibitor和pcDNA-THBS2共转染入MGC-803后, A：Western blot法检测细胞中THBS2蛋白表达； B：RT-qPCR法检测细胞中THBS2 mRNA表达, 与NC+pcDNA-Con组相比,aP＜0.05； 与miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-Con组相比, cP＜0.05, n = 3； C：CCK-8法检测细胞活性, 与NC+pcDNA-Con组相比, aP＜0.05, bP＜0.01；与miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-Con组相比, cP＜0.05, dP＜0.01, n = 3； D、E：集落形成实验检测细胞的集落形成, 与NC+pcDNA-Con组相比,aP＜0.05； 与miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-Con组相比, cP＜0.05, n = 3； F-H：Transwell法检测细胞的迁移与侵袭能力； 与NC+pcDNA-Con组相比,aP＜0.05； 与miR-10a-5p inhibitor+pcDNA-Con组相比, cP＜0.05, n = 3.RT-qPCR：实时荧光定量PCR.

实验方法

用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)检测miR-10a-5p在GC组织和细胞中表达.用CCK-8法, 集落形成法和Transwell法评估miR-10a-5p敲低对GC细胞增殖, 集落形成, 迁移和侵袭的影响.预测miR-10a-5p的靶基因, 并验证.最后, 检测miR-10a-5p是否通过此靶基因在GC细胞上发挥作用.

实验结果

miR-10a-5p在GC组织和细胞中高表达； miR-10a-5p敲低能通过其靶基因THBS2发挥抑制GC细胞增殖.克隆形成, 迁移与侵袭的作用.

实验结论

抑制miR-10a-5p表达能通过靶基因THBS2发挥抑制GC细胞生长和转移的作用.

展望前景

本研究为GC的治疗提供了参考靶点.