miR-637靶向ERBB3对胃癌细胞迁移、侵袭及凋亡的影响及分子机制研究

何孝明, 王金鑫, 杨 剑

何孝明, 浙江省医疗健康集团杭州医院急诊科 浙江省杭州市 310022

王金鑫, 浙江省医疗健康集团杭州医院消化内科 浙江省杭州市310022

杨剑, 浙江省医疗健康集团杭州医院肿瘤内科 浙江省杭州市 310022

核心提要：miR-637可通过下调ERBB3的表达抑制胃癌细胞SGC-7901迁移、侵袭, 并促进细胞凋亡.

0 引言

胃癌(gastric cancer, GC)消化系统恶性肿瘤之一, 死亡率高, 严重威胁着人民的生命和健康, 其中侵袭和转移是导致GC患者死亡的重要原因, 探索GC侵袭、转移的相关机制, 对GC的诊断、治疗、预后评估具有重大意义[1].随着在分子水平上对GC生物学行为机制研究, 分子靶向治疗已成为治疗GC的研究热点[2].miRNA是一类内源性非编码小RNA, 在转录后水平调控基因的表达, miRNA通过与GC相关的调控基因或mRNA结合, 使目的mRNA表达沉默或增强, 导致GC细胞的侵袭和转移[3].有研究利用高通量的miRNA芯片检测在GC中差异表达的miRNA, 发现miR-637在GC中下调表达, 是高转移潜能GC细胞中差异表达的miRNA分子[4].miR-637过表达抑制了甲状腺乳头状癌细胞侵袭迁移能力[5].miR-637还可以通过抑制周期素依赖性激酶4(Cyclindependent kinase 4, CDK4)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2, Bcl-2)和基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2, MMP-2)的表达抑制结肠癌HCT116细胞的生长和迁移[6].erb-b2受体酪氨酸激酶3(erb-b2 receptor tyrosine kinase 3, ERBB3)是ERBB家族成员之一, 是一种癌基因, ERBB3蛋白在GC中过表达,与患者预后不良相关, 其可能与其参与了GC的低分化病理过程[7].ERBB3还可以抑制乳腺肿瘤细胞增殖[8].但目前miR-637对GC细胞生物行为的影响及其机制还不清楚.本实验旨在研究miR-637对GC细胞迁移、侵袭及凋亡的影响及其分子机制是否与ERBB3有关.

1 材料和方法

1.1 材料 GC细胞SGC-7901购自中国科学院上海细胞库； 癌旁组织和GC组织取自当地肿瘤医院； 胎牛血清、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶购自美国Gibico公司； Lipofectamine TM 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司； Trizol试剂、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自日本TaKaRa公司； 双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京Solarbio公司； 膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)和碘化丙锭(PI)试剂盒、RIPA蛋白裂解液、SDS-PAGE试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司； 二甲基亚砜(DMSO)、BCA试剂盒、PBS缓冲液购自Sigma公司； Transwell小室、Matrigel胶购于美国BD公司； 抗体均购自上海煊翎生物科技有限公司.E-cadherin(货号12886R)、MMP-2(货号20705R)、ERBB3(货号1454R)、Bax抗体(货号20386R)、Bcl-2(货号20352R)购自上海彩佑实业有限公司； 山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶(货号BHR101)购自北京博尔西科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：GC细胞SGC-7901用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下培养, 隔天换液一次, 待细胞融和至80%左右时, 加入胰蛋白酶进行消化传代, 选取处于对数生长期的细胞进行实验.

1.2.2 细胞转染与分组：取对数生长期的GC细胞SGC-7901用0.25%胰蛋白酶消化后接种于96孔板中, 待细胞生长至80%融合, 更换为无血清培养基同步化12 h, 随后进行转染.将miR-NC、miR-637、anti-miR-NC、antimiR-637、si-NC、si-ERBB3分别转染至SGC-7901细胞中, 记为miR-NC组、miR-637组、anti-miR-NC组、antimiR-637组、si-NC组、si-ERBB3组； 将miR-637分别与pcDNA3.1和 pcDNA3.1-ERBB3共同转染至SGC-7901细胞中, 记为miR-637+pcDNA3.1组和miR-637+pcDNA3.1-ERBB3组, 转染均按照LipofectamineTM 2000试剂盒进行操作.

1.2.3 qRT-PCR检测miR-637表达水平：收集以上各组细胞, 研磨充分后加入Trizol试剂提取总RNA, 微量核酸测定仪检测RNA纯度和浓度.使用TaKaRa反转录试剂盒将RNA反转录成cDNA, 按照TaKaRa荧光定量试剂盒使用说明配制反应体系, 以β-actin为内参进行PCR扩增, 每个样品重复3次, 循环条件为95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s； 72 ℃30 s, 共40个循环； 72 ℃延长5 min.相对表达量采用2-△△Ct法计算.

1.2.4 Western blot检测蛋白表达：收集各组细胞, 加入RIPA裂解液裂解, 4 ℃, 12000 g离心15 min, 收集蛋白上清液, BCA试剂盒测定蛋白浓度.将蛋白样品进行SDSPAGE电泳后转至PVDF膜上, 5%脱脂奶粉封闭液室温封闭1 h.分别加入一抗(1：800), 4 ℃孵育过夜, TBST洗膜； 加入二抗(1：1000)室温孵育2 h, TBST洗涤3次, 每次10 min, 后在暗室中曝光显影, 再浸入定影, 最后洗去残液晾干, 将胶片用Quantity One凝胶分析软件处理, 测定各组蛋白条带的吸光度, 以目的条带和GAPDH条带的比值作为蛋白表达水平.

1.2.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭：在各组细胞, 胰酶消化后使用无血清培养基重悬细胞, 调整浓度为2×104个/mL.以1：5比例加入RPMI 1640培养液稀释Matrigel后,铺于Transwell小室的上室, 室温下干燥后, 取200 μL细胞悬液接种于Transwell小室上室中, 并置于含完全培养基的下室中, 37 ℃、5%CO2条件下培养24 h, 取出小室,去除培养基后用棉签轻轻擦去上层细胞, PBS洗涤, 加入4%多聚甲醛固定30 min, 0.1%结晶紫染色10 min, 显微镜观察并随机选取5个视野拍照.最后显微镜下观察结晶紫染色细胞数即为侵袭细胞数.

1.2.6 流式细胞术检测细胞凋亡：用不含EDTA的胰酶消化各组细胞, 离心收集各组细胞, PBS漂洗2次, 加结合缓冲液重悬细胞.依据试剂盒说明书, 先后加入Annexin V-FITC和PI避光孵育.流式细胞仪检测激发波长488 nm和发射波长530 nm处的荧光强度.实验重复3次.

1.2.7 荧光素酶报告基因检测实验检测miR-637对ERBB3的靶向调控：TargetScan数据库显示ERBB3 3′UTR区域有miR-637结合位点.构建野生型和突变型基因靶点ERBB3的3′UTR-荧光素酶表达载体(WT-ERBB3和MUT-ERBB3), 取对数生长期GC细胞SGC-7901接种于24孔板(5×104个/孔), 待细胞生长至80%融合时, 用Lipofectamine TM 2000将WT-ERBB3和MUT-ERBB3分别与miR-NC和miR-637共转染至GC细胞SGC-7901中.依据说明书要求, 使用荧光素酶报告基因检测仪进行双荧光素酶报告实验测定.实验结果以荧光素酶活性和Renilla活性的比值进行统计学分析.实验重复3次.

统计学处理采用SPSS 20.00进行统计学分析.计量资料以mean±SD表示, 两组比较行t检验, 多组间比较采用单因素方差分析, 以P＜0.05表示差异有统计学意义.

2 结果

2.1 miR-637在GC组织和癌旁组织中的表达 qRT-PCR检测结果(图1)显示, 与癌旁组织相比, GC组织中miR-637的表达水平显著降低(P＜0.05).可见, miR-637在GC组织中低表达.

2.2 过表达miR-637对GC细胞SGC-7901迁移、侵袭的影响 qRT-PCR检测结果(图2A)显示, 与miR-NC组相比,miR-637组细胞SGC-7901中miR-637表达水平显著升高(P＜0.05).Transwell法检测结果(图2B、C)显示, 与miRNC组相比, miR-637组细胞SGC-7901迁移、侵袭数量显著降低(P＜0.05).Western blot检测结果(图2D、E)显示, 与miR-NC组相比, miR-637组细胞SGC-7901中上皮钙黏蛋白(epithelial cadherin, E-cadherin)表达水平显著升高, MMP-2表达水平显著降低(P＜0.05).可见, 过表达miR-637抑制GC细胞SGC-7901迁移、侵袭.

2.3 过表达miR-637对GC细胞SGC-7901凋亡的影响 流式细胞仪检测结果(图3A、B)显示, 与miR-NC组相比,miR-637组细胞SGC-7901的凋亡率显著升高(P＜0.05).Western blot检测结果(图3C、D)显示, 与miR-NC组相比, miR-637组细胞SGC-7901中Bax表达水平显著升高,Bcl-2表达水平显著降低(P＜0.05).可见, 过表达miR-637促进GC细胞SGC-7901凋亡.

以电力系统、天然气系统以及可再生能源系统等多种能源网络耦合互联形成的多能互补综合能源系统集结整合了不同能源网络，同时满足了区域内用户电、热、冷、气等多种能源需求，使用户能源需求与各种能源系统的关联度都大大增强，具有更高的能源利用率和供能可靠性。如何协调不同的能源系统，充分发挥综合能源的多能协同特性来提高系统运行的经济性、环保性、节能性等性能是一个重要的研究方向。

2.4 miR-637靶向、调控ERBB3的表达 通过starbase网站预测到ERBB3与miR-637存在结合位点(图4A).荧光素酶报告基因检测实验结果(图4B)显示, 相较于miRNC组, miR-637组WT-ERBB3GC细胞SGC-7901的荧光素酶活性显著降低(P＜0.05)； 而MUT-ERBB3GC细胞SGC-7901的荧光素酶活性差异不显著.Western blot检测结果(图4C、D)显示, 相较于miR-NC组, miR-637组GC细胞SGC-7901中ERBB3表达水平显著降低； 相较于antimiR-NC组, anti- miR-637GC细胞SGC-7901中ERBB3表达水平显著升高(P＜0.05).可见, miR-637可靶向调控ERBB3的表达.

2.5 抑制ERBB3对GC细胞SGC-7901迁移、侵袭及凋亡的影响 流式细胞仪检测结果(图5A)显示, 与si-NC组相比, si-ERBB3组细胞SGC-7901的凋亡率显著升高(P＜0.05).Transwell法检测结果(图5B)显示, 与si-NC组相比, si-ERBB3组细胞SGC-7901迁移、侵袭数量显著降低(P＜0.05).Western blot检测结果(图5C、D)显示, 与si-NC组相比, si-ERBB3组细胞SGC-7901中E-cadherin、Bax表达水平显著升高, ERBB3、MMP-2、Bcl-2表达水平显著降低(P＜0.05).可见, 抑制ERBB3抑制细胞SGC-7901迁移、侵袭, 促进细胞凋亡.

2.6 过表达ERBB3能逆转miR-637对GC细胞SGC-7901迁移、侵袭及凋亡的作用 qRT-PCR检测结果(图6A)显示, 与miR-NC组相比, miR-637组细胞SGC-7901中miR-637表达水平显著升高； 与miR-637+pcDNA3.1组相比,miR-637+pcDNA3.1-ERBB3组miR-637表达水平显著降低(P＜0.05).流式细胞仪检测结果(图6B)显示, 与miRNC组相比, miR-637组细胞SGC-7901的凋亡率显著升高； 与miR-NC组相比, miR-637组细胞SGC-7901的凋亡率显著降低(P＜0.05).Transwell法检测结果(图6C)显示,与miR-NC组相比, miR-637组细胞SGC-7901迁移、侵袭数量显著降低； 与miR-637+pcDNA3.1组相比, miR-637+pcDNA3.1-ERBB3组细胞SGC-7901迁移、侵袭数量显著升高(P＜0.05).Western blot检测结果(图6D、E)显示, 与miR-NC组相比, miR-637组细胞SGC-7901中E-cadherin、Bax表达水平显著升高, ERBB3、MMP-2、Bcl-2表达水平显著降低； 与miR-637+pcDNA3.1组相比, miR-637+pcDNA3.1-ERBB3组细胞SGC-7901中E-cadherin、Bax表达水平显著降低, ERBB3、MMP-2、Bcl-2表达水平显著升高(P＜0.05).可见, 过表达ERBB3能逆转miR-637对细胞SGC-7901迁移、侵袭抑制及凋亡促进的作用.

3 讨论

GC是发病率和死亡率较高的的恶性肿瘤, 其异质性高,易转移, 治疗预后效果差[9].研究其发病的分子机制对于治疗GC具有重要意义.miRNA虽不编码蛋白, 但广泛参与细胞的各个生理过程, 与肿瘤的发生发展也密切相关, 大量研究证实miRNA通过参与肿瘤细胞的生长、迁移、侵袭以及凋亡等过程从而调控GC进程[10].miR-637通过靶向调控CTSB从而显著降低了胆管癌QBC939细胞的增殖、迁移与侵袭能力, 并促进细胞凋亡[11].上调miR-637抑制乳头状甲状腺癌细胞的增殖, 侵袭和迁移[12].强制过表达miR-637显著抑制肝癌细胞生长并诱导细胞凋亡[13].抑制miR-637转录还促进胶质瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[14].在本研究中也发现了相一致的研究结果, 本实验结果显示GC组织中miR-637的表达水平显著降低, 过表达miR-637可抑制GC细胞SGC-7901迁移、侵袭, 促进细胞凋亡.

只有不到20%的创业训练项目和创业实践项目质量高，仅仅有20%的学生和29%的老师认为目前创新计划项目能够落地。创业项目转化和落地率偏低目前高校创新创业教育中存在的突出问题。从总体上来看，目前高校许多创业项目多为传统项目，科技含量不高，即使能够落地，也难以持续经营。少数科技含量较高的创业项目，存在科技成果对接能力不足的问题，难以将技术转化成落地的创业项目(周琼琼，2015)。

ERBB3是一种促增殖基因, 可形成二聚体, 激活下游信号传导通路, 从而调控肿瘤的增殖、迁移、粘附、凋亡和血管生成等过程[15].miR-148a-3p可以直接调控ERBB3基因的表达, 下调ERBB3能显著抑制膀胱癌细胞的增殖、体外克隆形成、促进G1期周期阻滞,抑制迁移和侵袭能力[16].下调ERBB3通过抑制MTK-1的表达来抑制宫颈癌细胞的增殖、迁移和侵袭, 从而抑制肿瘤的发展[17].miR-143/145负调控ERBB3基因表达水平从而抑制乳腺癌细胞的增殖及迁移能力[18].本实验结果显示, 抑制ERBB3表达可抑制GC细胞SGC-7901迁移、侵袭, 促进细胞凋亡.且ERBB3受miR-637靶向调控, 过表达ERBB3能逆转miR-637对GC细胞SGC-7901迁移、侵袭抑制和凋亡促进的作用.过表达miR-637和E-cadherin是上皮-间质转化过程中一种主要的蛋白标志物, E-cadherin表达减少或缺失是导致肿瘤细胞发生侵袭和转移的重要因素[19].MMP-2是肿瘤转移和侵袭过程中重要的调控分子, MMP-2通过降解细胞外基质、促进新生血管形成、调节细胞间的粘附等机制,促使肿瘤发生侵袭和转移[20].过表达miR-637和ERBB3抑制表达均抑制MMP-2的表达, 促进E-cadherin的表达,说明其抑制了细胞侵袭和转移.而Bcl-2和Bax是细胞凋亡相关蛋白, Bcl-2是抑凋亡因子, Bax是促凋亡因子, 过表达miR-637和抑制ERBB3表达均抑制了Bcl-2的表达,促进Bax的表达； 说明其促进了细胞凋亡.且进一步的研究也发现过表达miR-637和抑制ERBB3表达细胞迁移和侵袭数量显著降低, 细胞凋亡率显著升高.且miR-637靶向调控ERBB3, 提示miR-637对GC细胞迁移、侵袭及凋亡的影响是通过调控ERBB3的表达进而影响迁移、侵袭及凋亡相关蛋白的表达而实现的.

图1 miR-637的表达.与癌旁组织组比较, aP＜0.05.

图2 过表达miR-637对胃癌细胞SGC-7901迁移、侵袭的影响.A：miR-637的表达； B、C：Transwell法检测结果； D、E：Western blot检测结果.与miR-NC组比较, aP＜0.05.E-cadherin：上皮钙黏蛋白； MMP-2：基质金属蛋白酶2.

图3 过表达miR-637对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响.A、B：流式细胞仪检测结果； C、D：Western blot检测结果.与miR-NC组比较,aP＜0.05.Bcl-2：B细胞淋巴瘤/白血病-2； Bax：Bcl-2相关X蛋白.

图4 miR-637靶向、调控ERBB3.A：ERBB3的3’UTR含有miR-637的互补序列； B：双荧光素酶报告实验； C, D：miR-637调控ERBB3的表达.与miR-NC组比较, aP＜0.05； 与anti-miR-NC组比较, cP＜0.05.ERBB3：人类表皮生长因子受体3.

图5 抑制ERBB3对胃癌细胞SGC-7901迁移、侵袭及凋亡的影响.A：抑制ERBB3对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响； B：抑制ERBB3对胃癌细胞SGC-7901迁移、侵袭的影响； C、D：抑制ERBB3对胃癌细胞SGC-7901迁移、侵袭及凋亡蛋白表达的影响.与si-NC组比较, aP＜0.05.ERBB3：人类表皮生长因子受体3； E-cadherin：上皮钙黏蛋白； MMP-2：基质金属蛋白酶2； Bcl-2：B细胞淋巴瘤/白血病-2； Bax：Bcl-2相关X蛋白.

图6 过表达ERBB3能逆转miR-637对胃癌细胞SGC-7901迁移、侵袭及凋亡的影响.A：miR-637的表达； B：过表达ERBB3能逆转miR-637对胃癌细胞SGC-7901凋亡的影响； C：过表达ERBB3能逆转miR-637对胃癌细胞SGC-7901迁移、侵袭的影响； D、E：过表达ERBB3能逆转miR-637对胃癌细胞SGC-7901迁移、侵袭及凋亡蛋白表达的影响.与miR-NC组比较, aP＜0.05； 与miR-637+pcDNA3.1组比较, cP＜0.05.ERBB3：人类表皮生长因子受体3； E-cadherin：上皮钙黏蛋白； MMP-2：基质金属蛋白酶2； Bcl-2：B细胞淋巴瘤/白血病-2； Bax：Bcl-2相关X蛋白.

综上所述, miR-637可抑制GC细胞SGC-7901迁移、侵袭, 促进细胞凋亡, 其机制可能与靶向下调ERBB3及迁移、侵袭及凋亡相关蛋白表达有关, 将可为GC的预防和治疗提供新靶点.本实验目前仅在体外细胞层面进行实验, 下一步需要在类似体内环境的动物模型中进行研究验证, 为以后可能的临床应用提供理论参考依据.

文章亮点

实验背景

胃癌(gastric cancer, GC)是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率、死亡率较高, 手术、放化疗是其主要治疗手段, 但术后易复发, 放化疗副作用高且易产生耐药性使得治疗效果不佳, 靶向治疗的出现给GC治疗提供了新方向.miR-637参与了结肠癌、胆管癌、甲状腺癌、卵巢癌等多种癌症的进展, 具有抑癌作用, 但miR-637对GC是的发生发展的影响和机制尚不清楚.

实验动机

本文主要研究miR-637对GC细胞SGC-7901迁移、侵袭和凋亡的影响, 并研究其作用机制是否与人类表皮生长因子受体3(human epidermal growth factor receptor 3,HER3/ERBB3)有关, 为GC的分子靶向治疗及预后等提供可能的靶点和生物标志物.

阐明miR-637对GC细胞SGC-7901迁移、侵袭和凋亡的影响及其分子机制, 旨在为miR-637在GC靶向治疗及分子靶点药物研发中提供理论基础.

实验方法

体外培养人GC细胞SGC-7901, 分别采用qRT-PCR检测miR-637的表达水平； Western blot检测迁移、侵袭和凋亡相关蛋白表达； 流式细胞术检测细胞凋亡； 过表达miR-637和抑制ERBB3表达后, 观察其对GC细胞迁移、侵袭和凋亡的影响, 双荧光素酶报告基因实验验证miR-637和ERBB3的靶向关系.同时过表达miR-637和ERBB3, 观察ERBB3对过表达miR-637的GC细胞迁移、侵袭和凋亡的影响.

实验结果

miR-637可抑制GC细胞SGC-7901迁移、侵袭, 促进细胞凋亡, 且miR-637靶向负调控ERBB3, 过表达ERBB3逆转了miR-637对GC细胞迁移、侵袭抑制和凋亡促进作用.达到了本实验的目的, 对该领域GC的发病进展机制又增加了相关的理论依据, 以后可以进一步在临床方面进行研究应用.

实验结论

新发现：miR-637靶向负调控ERBB3； 过表达miR-637和抑制ERBB3表达均可抑制GC细胞迁移和侵袭、促进细胞凋亡； 新的理论：miR-637可以通过调控ERBB3影响GC迁移、侵袭和凋亡相关蛋白的表达进而影响GC的进展.从miRNA和其靶基因角度去研究其对GC恶性生物学行为的影响, 拓宽了研究的范围, 不同miRNA影响急性胰腺炎的进展的机制不同, 增加了其治疗的靶点.不同的miRNA在miR-637中的表达及其作用机制不同,可通过研究不同的miRNA及其靶基因对GC的影响可拓展研究思路.miR-637通过靶向负调控ERBB3影响GC细胞迁移、侵袭和凋亡.通过上调或下调miRNA进而影响其靶基因的表达可以影响GC的进展.对未来临床诊断和治疗提供了新的标志物和新靶点.

展望前景

仅在体外细胞的理论层面上进行研究, 需要进一步在临床上进行相关研究和应用.未来进一步深入研究miR-637和ERBB3对治疗GC的影响及其可能会产生的其他现象及是否会有副作用； 以及进一步向临床方向的研究靠拢.用更接近于真实GC的小鼠或其他受体为模型, 在其基础上进行实验治疗, 对其反应状况进行观察研究.