动脉粥样硬化“痰瘀”演变的内在机制研究*

★ 喻松仁 周丽 周步高 艾志福 程绍民 曹阳 袁肇凯

(1.江西中医药大学 江西 南昌 330004；2.湖南中医药大学 湖南 长沙 410007)

已有研究表明，AS(atherosclerosis,AS)属中医“痰浊”、“瘀血”范畴，“痰凝”、“血瘀”是其主要病理改变，应用“痰瘀相关理论”可阐释AS形成发展机制[1]。但AS痰瘀演变的形成机理和物质基础如何，对此并不十分清楚。故笔者采用维生素D3复合高脂饲养复制大鼠AS模型，通过动态观察血脂、血液流变学、形态学和脂质代谢相关通路基因表达等的变化，探讨AS“痰瘀”的演变规律。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级雌性和雄性SD大鼠各28只，共56只，体重250±20g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)2009-0004。

1.1.2 主要试剂 胆固醇购自安徽天启化工科技有限公司；丙基硫氧嘧啶购自南通精华制药有限公司；维生素D3针剂购自哈尔滨宏达动物药品厂；RT试剂盒购自TAKARA公司；Trans Ex Taq PreMix购自Trans公司；Trizol购自Trans公司；DEPC购自Amresco公司；引物源自Invitrogen公司；琼脂糖购自Promega公司；溴化乙锭(EB)购自Sigma公司；6×Loading Buffer购自Takara公司；Trans DNA MarkerⅠ购自Trans公司；血脂试剂盒购自中生北控生物科技股份有限公司。白糖、猪油购于市场；基础饲料由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

1.1.3 主要仪器与设备 XY3000BF精密电子天平，常州市幸运电子设备有限公司；thermo冷冻高速离心机，德国thermo公司；SA-5600型全自动血流变分析仪，北京赛科希德科技发展有限公司；HITACHI7020全自动生化分析仪，日本；Leica RM2255石蜡切片机，德国莱卡仪器有限公司LEICA；PCR仪，德国eppendorf公司；电泳仪及电泳槽，北京六一公司；Js-380自动凝胶图像分析仪，上海培清科技有限公司；DM2000生物显微镜，德国莱卡仪器有限公司；Leica DFC425C-数码摄像头，德国莱卡仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物造模和分组 参照文献[2]方法造模，其饲料配制为：3.5%胆固醇、10%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.1%胆酸钠、5%奶粉、5%花生、7%蔗糖、5%蛋黄粉、64.2%基础饲料(主要包括面粉、米粉、玉米、麸皮、豆料等)，搅匀后制成高脂饲料。将实验大鼠随机分为正常组16只，造模组40只，正常组用普通饲料喂养，造模组用高脂饲料喂养。模型组在高脂饲料喂养的第1天腹腔注射维生素D3针剂(70×105u/kg体重)，喂养后的第14天腹腔注射维生素D3针剂(10×105u/kg体重)。以动物出现血脂增高作为“痰凝心脉证”，以血脂增高和血液流变学异常作为“痰瘀痹阻证”，以主动脉的形态学改变作为AS造模成功的标准。

1.2.2 取材和检测 饲喂高脂饲料，分别于3、7、10、13周随机处死大鼠，每次处死10只造模组大鼠及4只正常组大鼠。心脏采血，采血量约为7～9mL，分成2份，分别测血脂(LDL用Friedewald公式计算)、血液流变学指标。然后从主动脉弓处剪取1cm长一段，置于10%的甲醛溶液中固定后，各取组织块逐级酒精脱水，石蜡包埋，常规连续切片(厚约5μm)，行Gill苏木素．伊红(HE)染色，镜下观察。同时截取0.5cm长的一段主动脉，100mg肝组织左叶，剥外膜，在生理盐水中漂洗2次，投入液氮中；Trizol法抽提总RNA，DNase I处理后，采用紫外分光光度计测定其浓度，取1μg总RNA，以Oligo(dT)18为引物、M-MLV为逆转录酶进行逆转录反应，参照GenBank中靶基因mRNA的序列设计引物(基因引物设计如下)，靶基因和内参分别在最佳条件下及PCR循环的线性期内扩增，琼脂糖凝胶电泳分析．采用Image Pro Plus version 5.0软件分析电泳条带灰度，与β-action灰度测定比值代表其mRNA表达的相对水平。

实验目的基因引物设计：(1)PPARγ：上游引物5'ATTCTGGCCCACCAACTTCGG 3'，下游引物5'TGGAAGCCTGATGCTTTATCCCC 3'可扩增长339bp的cDNA片段；(2)INSIGN2：上游引物5' CCTAAAAAGCGTGGCCCCTA 3'，下游引物5' TGGCTCTCCTAGATGCCTGT 3'可扩增长264 bp的cDNA片段；(3)SCAP：上游引物5'CCGGGTCAGCCATACATTTG 3'，下游引物5'CCAGGTCCTGCTGAATGGAGT'可扩增长149bp的cDNA片段；(4)SREBP2：上游引物5'TGCATGAAGCAACTGTTCGAC 3'，下游引物5'CCGTGTTTGGTGTTCTGAGTG'可扩增长106bp的cDNA片段；(5)内参照：根据其各自片段大小的差异，分别选用207bp或484bp作为β-actin内参照：序列是207bpβ-actin：上游引物5' CACCCGCGAGTACAACCTTC 3'，下游引物5' CCCATACCCACCATCACACC 3'；序列是484bpβ-actin：上游引物5' AGAGGGAAATCGTGCGTGACATT3'，下游引物5' CCGGACTCATCGTACTCCTGCTT 3'。

2 研究结果

2.1 AS大鼠痰瘀演变与血脂的动态观察 结果见表1。

从表1可知，正常组各模型周期血脂指标无显著差异；在造模的第3周脂质代谢紊乱明显，说明“痰凝”的病例模型已经形成，这与相关文献报道一致[3]，随着造模时间的延长，各模型周期TC、TG、LDL逐渐升高、HDL逐渐降低(P<0.01或P<0.05)，映证了TC、TG、LDL逐渐升高、HDL逐渐降低是AS痰浊的主要特征和生化物质基础[4]，并提示“痰浊”量变贯穿于AS发生、发展和变化的整个病理过程，是本病迁延不愈、变证丛生的关键因素。

2.2 AS大鼠痰瘀演变与血液流变学的动态观察 结果见表2。

从表2可知，正常组大鼠各模型周期血液流变学的检测值无显著差异；随着造模时间的延长，TC、LDL、TG值的升高，造模大鼠各模型周期血液流变学改变呈升高趋势，血行瘀滞不断加重，尤其是造模第10与第13周比较有显著改变，其中全血高切、中切和血浆粘度具有显著差异(P<0.01或P<0.05)，表明随着血中之痰浊(脂质代谢异常)不断积聚，势必诱使“瘀”的形成，亦即“痰可致瘀”。亦说明“瘀”是痰浊深入发展的必然产物。结果也提示了“痰瘀痹阻”阶段的大鼠模型已经形成。

表1 AS大鼠“痰瘀”演变与血脂的变化

注：1.与正常组比较，**P<0.01，*P<0.05。2.模型组方差分析，##P<0.01,#P<0.05；3.模型7W与模型3W比较：○○P<0.01，○P<0.05；模型10W与模型7W比较：rrP<0.01，rP<0.05；模型13W与模型10W比较：ppP<0.01，pP<0.05。

表2 AS大鼠“痰瘀”演变与血液流变学的变化

注：同表1所注。

表3 AS大鼠“痰瘀”演变与PPAR、INSIG2、SCAP、SREBP2的变化

注：同表1所注。

图1 正常AS HE 20×10；图2 模型3周AS HE 20×10；图3 模型7周AS HE 20×10；图4 模型10周AS HE 20×10；图5 模型13周AS HE 20×10

2.3 AS大鼠痰瘀演变与病理组织学的动态观察 正常组大鼠动脉内皮细胞完整，单层紧贴内弹力板，中层平滑肌细胞排列整齐(见图1)；造模第3周见动脉管壁内皮细胞部分脱落，平滑肌细胞排列疏松(见图2)；造模第7周见动脉管壁轻度增厚，内膜下见少许泡沫细胞增生(见图3)；造模第10周可见动脉管壁部分区域增厚，增厚处内膜、中膜可见泡沫细胞，部分区域见纤维组织的增生(见图4)；造模第13周见动脉管壁全周增厚较明显，管壁厚度不均匀，内膜管腔面见纤维组织增生形成纤维帽，其下见大量泡沫细胞沉积并伴有淡红染无定型物质的形成(见图5)。说明AS模型已经形成，且随着痰瘀的演变主动脉损伤逐渐加重。

2.4 AS大鼠痰瘀演变大鼠与脂质代谢相关通路基因表达的动态观察 见表3。

图1 AS大鼠痰瘀演变PPARγ mRNA表达电泳图

图2 AS大鼠痰瘀演变INSIG2 mRNA表达电泳图

图3 AS大鼠痰瘀演变SCAP mRNA表达电泳图

图4 AS大鼠痰瘀演变SREBP2 mRNA表达电泳图

从表3和图6-9可知，正常组各模型周期PPAR mRNA、INSIG2 mRNA、SCAP mRNA和SREBP2 mRNA的表达量无显著差异；AS各模型周期PPARγ mRNA、INSIG2 mRNA、SCAP mRNA的表达量随着造模时间的延长而逐渐增加，且PPARγ mRNA表达量在各模型周期间比较均具有显著差异(P<0.01)，INSIG2 mRNA表达量在第3周与7周、第10周与13周间比较存在显著性差异(P<0.01或P<0.05)，SCAP mRNA表达在第7周与10周间比较差异明显(P<0.05)。说明AS“痰瘀”病理演变过程中PPARγ mRNA、INSIG2 mRNA、SCAP mRNA表达量总体上有上调的趋势；各模型周期SREBP2 mRNA的表达量随着造模时间的延长而逐渐下降，存在显著性差异(P<0.01)，说明AS“痰瘀”病理演变过程中SREBP2 mRNA表达量有下调的趋势。

3 讨论

从血脂等生化指标的改变来看，脂质代谢异常贯穿于冠心病痰瘀病理改变的始末，而血液流变学改变在造模后期表现得更为显著。故而结合文献研究，认为脂质代谢异常是“痰浊”产生的主要特征和物质基础，是AS发生的始动因素，并贯穿痰瘀演变的始末；血液流变学改变是痰瘀演变的客观指征，是AS继发性改变，并非冠心病的始动环节。随着血脂改变而引发血液流变学变化，AS因“痰”而致“痰瘀”的演变也在逐渐形成，病情也在逐渐加重。

从病理组织学来看，由正常到“痰瘀”的形成，动脉病变也更为严重，除了管壁内皮细胞部分脱落、平滑肌细胞排列疏松和泡沫细胞增生外，进一步发展而见内膜管腔面纤维组织增生，并形成纤维帽，且其下见多量泡沫细胞沉积和淡红染无定型物质。如此则血管弹性下降，脆硬度增加，进而影响动脉血管的正常功能，也证实了高脂诱导的脂质代谢的紊乱会造成AS病理改变，且随痰瘀演变的迁移而逐渐加重。

从分子水平来看，运用RT-PCR法动态观察脂质代谢相关通路基因的表达，发现PPAR mRNA、INSIG2 mRNA、SCAP mRNA表达量随着由“痰”致“瘀”的演变而呈上调趋势，而SREBP2 mRNA的表达量则呈下降趋势。痰瘀演变过程中，SREBP2 mRNA表达水平的降低，有利于反馈调节减少内源性胆固醇的生物合成，从而缓解外周血脂代谢紊乱状况[5]；而SCAP mRNA和INSIG2 mRNA表达水平显著升高，有利于形成SREBP-SCAP-INSIG复合体，将SREBP2锚定在内质网上，抑制其对下游基因的转录调控[6,7]。近年来，研究表明INSIG、SCAP、SREBPs代谢通路在保持细胞内胆固醇和脂肪酸的代谢平衡中起着重要的调节作用[8-11]；同时，在高脂血症形成过程中PPARγ mRNA在血管壁细胞中出现不同程度的表达，这有利于控制动脉粥样硬化斑块的脂肪代谢[7]。故脂质代谢相关通路基因的异常表达是可能是AS“痰瘀”病理演变的分子机制。由于脂质代谢通路基因表达的增强或减弱，在它们表达产物的共同作用下，引发脂质代谢紊乱等复杂病理变化，最终形成动脉粥样硬化，即由产物“痰浊”的量变过程而渐进为“痰瘀痹阻”。这些通路基因表达的改变，为我们有效地辨识“痰瘀”提供了分子生物学基础。

总之，从本项目研究结果来看，AS痰瘀演变与脂质代谢密切相关，脂质代谢通路相关基因的表达的增强或减弱可能是AS“痰瘀”衍变发生的内在机制。

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