正交试验优选雷公藤药材生物碱的提取工艺*

★ 许可为 朱若凯 蔡佳 陈丽华 吴德智

(1.江西中医药大学附属医院 江西 南昌330006;2.江西省医药采购服务中心 江西南昌330029;3.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室 江西南昌330004)

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)为卫茅科雷公藤属植物，对治疗风湿性关节炎、慢性肾炎、红斑狼疮以及肿瘤等自身免疫性疾病疗效显著。雷公藤生物碱类成分是雷公藤主要有效成分之一，具有明显的免疫抑制、抗肿瘤及抗生育等作用，且毒性远低于二萜类成分，具有良好应用前景［1］。文献报道［2］以雷公藤总生物碱提取率为评价指标优选了雷公藤药材生物碱的提取工艺，但仅从总生物碱提取率来考察提取工艺尚存不足。雷公藤吉碱和雷公藤次碱是雷公藤根皮提取物中含量较高的2种生物碱，同时也是主要的活性成分。因此本实验以雷公藤总生物碱、雷公藤吉碱、雷公藤次碱的提取率和浸膏得率为指标优选了雷公藤药材生物碱的提取工艺，为雷公藤生物碱的进一步研究提供依据。

1 仪器与试药

Agilent1200型高效液相色谱仪，包括四元梯度泵、真空脱气机、柱温箱、VWD检测器;UV2550型紫外分光光度计(日本岛津公司);TG328A十万分之一电子天平(德国Startorius公司)。

雷公藤药材(福建汉堂生物制药股份有限公司);雷公藤吉碱、雷公藤次碱(自制，纯度大于98%，面积归一法测得);乙腈、甲醇(色谱纯，美国TEDIA天地试剂公司);磷酸二氢钠(国药集团化学试剂有限公司);水为双蒸水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 雷公藤总生物碱的测定方法的建立

2.1.1 对照品溶液的配制 精密称取雷公藤吉碱对照品7.60mg，置于25mL量瓶中，加甲醇溶解并定量至刻度，摇匀，得浓度为304μg/mL的对照品储备液。

2.1.2 供试品溶液的配制 取正交设计供试品溶液8号，参考文献方法［2］提取液减压浓缩，用0.5 mol/L HCl溶液30 mL提取3次，合并酸液，用30 mL氯仿分2次萃取酸水液，弃去氯仿层，酸水中加入浓氨水调节pH至7左右，静置，用滤纸过滤，加浓氨水调节pH至9～11，再用90 mL氯仿分3次萃取至水中无生物碱为止，合并氯仿液，在旋转蒸发仪中浓缩至干，加入5%HCI溶液并定容至25 mL，即得雷公藤总生物碱供试品溶液。

2.1.3 测定波长的选择 精密量取雷公藤吉碱对照液，置于吸收池中，以甲醇溶液为空白，在200～400nm波长范围内扫描，268nm处有最大吸收，故选择268nm为测定波长。

2.1.4 线性关系考察 精密量取雷公藤吉碱对照品溶液1，1.5，2，2.5，3，3.5mL，置于 10mL 量瓶中，加甲醇溶解并定量至刻度，摇匀，在268nm波长处分别测定吸光值，以质量浓度(X，μg/mL)为横坐标，吸光度(Y)为纵坐标绘制标准曲线。回归方程和相关系数分别为:Y=0.0066X-0.00912，r=0.9993。说明雷公碱吉碱浓度在30.4～106.4μg/mL范围内与吸光度A具有良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 取“2.1.1”项下的对照品溶液，在268nm波长处测定吸光度，连续重复测定6次，计算RSD为0.11%(n=6)。

2.1.6 稳定性试验 取供试品溶液，分别于0，2，4，8，16，24h进行测定。测定268nm波长处吸光度，计算RSD为3.57%，结果显示供试品溶液在24h内测定结果稳定。

2.1.7 加样回收率试验 在已测定总生物碱浓度的雷公藤药材提取液中加入已知量约80%、100%、120%的雷公藤吉碱对照品，制备供试品溶液，进行测定，计算回收率。结果雷公藤总生物碱平均回收率为98.74%，RSD为1.54%。

2.1.8 总生物碱提取率的测定 于紫外分光光度计上测定各提取物溶液在268nm处的吸光度值，根据线性方程得到总生物碱含量，并按下列公式计算雷公藤药材中总生物碱的提取率。

2.2 雷公藤吉碱和雷公藤次碱测定方法的建立

2.2.1 色谱条件［3，4］色谱柱:Diamon sil C18(4.6mm ×250mm，5μm);柱温:25℃;流动相为乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钾水溶液梯度洗脱:1～12min梯度从55∶45变化为50∶50，12 ～13min梯度从50∶50 变化为 55∶45，13 ～20min 为 55∶45;流速:1mL/min;检测波长:268nm。进样量:20μL。

2.2.2 对照品溶液的配制 分别精密称取雷公藤吉碱、雷公藤次碱对照品5.10，4.80mg，置于25mL量瓶中，加甲醇溶解并定量至刻度，摇匀，分别得浓度为204，192μg/mL的对照品储备液。

2.2.3 标准曲线的绘制 分别精密吸取雷公藤吉碱和雷公藤次碱混合对照品储备液 0.5，1，2，3，4，5mL，置于10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。分别进样20μL，以进样浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性拟合，混合对照品色谱图见图1(A)。雷公藤吉碱和雷公藤次碱的线性方程和相关系数分别为:Y=5.190X+3.196，r=0.9994;Y=5.638X+4.473，r=0.9993。结果表明雷公藤吉碱和雷公藤次碱分别在10.2～81.6μg/mL和9.6～96μg/mL呈良好线性关系。

2.2.4 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液20μL，重复进样6次，测得峰面积积分值，计算得雷公藤吉碱和雷公藤次碱的RSD分别为0.97%和0.67%(n=6)。

2.2.5 稳定性试验 取正交设计供试品溶液8号，分别于0，2，4，8，12，24h 进样测定。计算雷公藤吉碱和雷公藤次碱质量浓度，得到RSD分别为1.34%和2.59%，结果显示供试品溶液在24h内测定结果稳定。

2.2.6 加样回收率试验 在已测定雷公藤吉碱和雷公藤次碱质量浓度的雷公藤生物碱提取液样品中加入已知量约为80%、100%、120%的混合对照品，制备供试品溶液进行测定，计算回收率。结果雷公藤吉碱和雷公藤次碱的平均回收率分别为96.03%、103.89%，RSD分别为0.96%、1.63%。

2.3 提取工艺考察 根据预试验考察结果，提取前浸泡1h，提取次数确定为2次。将提取液pH值、提取溶媒(乙醇)浓度、提取溶媒用量以及回流提取时间定为实验因素，每个因素备选3个水平。按照L9(34)正交试验表进行试验设计，各因素水平见表1。

表1 因素水平表

图1 混合对照品(A)、雷公藤药材提取液(B)的HPLC图谱

2.4 正交试验设计及结果 称取雷公藤药材20g，按表2安排的试验进行提取，合并2次提取液，按2.3项下方法制备生物碱样品，分别测定样品中雷公藤总生物碱、雷公藤吉碱、雷公藤次碱的提取率和干浸膏得率，雷公藤提取物的色谱图见图1(B)。试验结果采用综合评分进行评判［5］，选取雷公藤总生物碱提取率(y1)、雷公藤吉碱提取率(y2)、雷公藤次碱的提取率(y3)和干浸膏得率(y4)为考察指标，综合评分时指定雷公藤总生物碱提取率、雷公藤吉碱提取率、雷公藤次碱提取率、浸膏得率指标权重系数分别为0.4、0.25、0.25、0.1。规定雷公藤总生物碱提取率最高的为40分，最低的为0分，每升高1%则加5.47分［40/(19.61-12.30)］，同理雷公藤吉碱提取率每升高1%则加0.66分，雷公藤次碱提取率每升高1%则加0.97分，规定浸膏得率最低的为10分，最高的为0分，每升高1%则减去8.70分。试验结果见表2，方差分析结果见表3。

以综合评价值为考察指标，直观分析显示因素作用主次为A＞C＞B＞D，方差分析结果表明因素A、C对综合评分值具有显著影响，根据K值，因素应选A3B3C3D1。综合上述分析，确定最佳工艺为，即选择pH为4，分别用12、10倍量的80%乙醇回流提取2次，每次1h，第1次提取前浸泡1h。

2.5 验证试验 根据试验结果，按最佳优化条件进行3次试验，分别测得雷公藤总生物碱、雷公藤吉碱、雷公藤次碱的提取率和干浸膏得率。表4结果表明该提取工艺稳定可行。

表2 正交试验结果表

表3 方差分析

表4 验证试验结果

3 讨论

考察中药的提取工艺时，应选择能代表中药整体的多个与功效有关的活性成分作为指标。本实验选择雷公藤总生物碱提取率以及主要活性成分雷公藤吉碱、雷公藤次碱的提取率三项指标综合表征雷公藤生物碱的提取效率，同时兼顾浸膏得率，采用加权评分法综合表征雷公藤生物碱的整体特性，最终通过正交试验确定雷公藤生物碱提取的相关工艺参数，为雷公藤生物碱的提取提供依据。

在雷公藤总生物碱提取率的考察中，采用不同对照对总生物碱含量进行比较，最终选择含量较高的雷公藤吉碱作为对照品，测得的结果较为稳定，含量较高。同时建立了HPLC法同时测定雷公藤吉碱、雷公藤次碱的含量，在梯度洗脱条件的摸索中，考察了甲醇-水、乙腈-水和乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钠等系统的多种洗脱程序，结果以乙腈-0.02mol/L磷酸二氢钠可以得到良好的分离效果，2种成分的峰形对称，结果稳定，可用于2种成分的定量分析。

［1］舒孝顺，高中洪，杨祥良，等.雷公藤生物碱的化学和药理活性研究进展［J］.广东药学院学报，2003，19(2):150-152.

［2］周琳，冯俊涛，马志卿，等.雷公藤提取农药用总生物碱工艺的优化［J］.农业工程学报，2008，24(12):287-290.

［3］陈列忠，王开金，陈建明，等.RP-HPLC法同时测定不同产地雷公藤根皮中3种生物碱的含量［J］.药物分析杂志，2007，27(2):191-193.

［4］张聪聪，黄建明，俞媚华，等.HPLC法测定雷公藤提取物中雷公藤甲素及两种生物碱的含量［J］.复旦大学学报(医学版)，2009，36(3):333-336.

［5］王光发，廖正根，梁新丽，等.正交试验优选四臣止咳颗粒处方药材的提取工艺［J］.中草药，2009，40(2):1 901-1 904.