外泌体在胰腺肿瘤早期诊断、治疗和预后方面的临床价值

夏文雯 陈玮 王强 赵严

1同济大学附属第十人民医院消化内科，上海 200072；2张家港市第二人民医院消化内科，张家港 215600

外泌体(exosomes)是一种40～100 nm大小，含有DNA、RNA和蛋白质的细胞外囊泡，在肿瘤的生长和迁移中发挥着重要作用。所有活细胞都会产生外泌体，而癌细胞产生的外泌体较正常细胞更多。外泌体的脂质双层膜可以保护内部的核酸，使其免被血浆中的核酸酶分解，使内部核酸能以高分子量形式存在，这些高质量DNA材料使分子分析具有更高的分辨率和敏感性[1]。体液检测肿瘤外泌体的简便性大大推动了外泌体在癌症诊断效用方面的研究。部分研究表明外泌体不仅可以帮助诊断疾病，还与治疗的反应及疾病预后相关。

1．外泌体核酸与胰腺肿瘤早期诊断：外泌体中含有高质量的核酸，通过核酸来早期诊断胰腺癌是近几年的研究热点。Madhavan等[2]研究发现，血清外泌体上癌症起始细胞标记和miRNA标记的互补性增强了基于血清外泌体的胰腺癌诊断的可靠性，并且证实了这种检测手段在大规模临床评估上的稳定性。Goto等[3]通过下一代测序分析评估了胰腺癌或导管内乳头状黏液性肿瘤(intraductal papillary mucinous neoplasm, IPMN)患者和没有肿瘤患者的外泌体miRNA(ex-miRNA)的表达，发现与对照组相比，胰腺癌和IPMN患者中ex-miR-191、ex-miR-21和ex-miR-451a的表达显著上调，且这3种ex-miR的诊断准确性比血清miRNA高5%～20%。Kitagawa等[4]也发现血浆中部分信使RNA和小核仁RNA，如WASF2、ARF6、SNORA74A和SNORA25被包裹在外泌体中并从培养的胰腺癌细胞中分泌，且WASF2水平与胰腺癌风险的相关性最高，可用于胰腺癌的早期诊断。Nakamura等[5]研究了PDAC和CP患者胰液中提取的外泌体，发现与CP患者相比，PDAC患者中ex-miR-21和ex-miR-155的相对水平明显更高，而胰液miR-21和miR-155的相对水平差异无统计学意义，证明胰液中的部分外泌体miRNA，如ex-miR-21和ex-miR-155也可作为PDAC的生物标志物。

KRAS基因突变在胰腺癌患者中常见，其可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡。Allenson等[6]发现KRAS突变体阳性与胰腺癌相关，而检测外泌体DNA中的突变型KRAS比检测血浆循环DNA具有更高的效用。

2．外泌体蛋白质与胰腺肿瘤早期诊断：外泌体中蛋白质的差异性表达也是胰腺癌早期诊断标志物的研究热点。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican 1, GPC1)在PDAC细胞和邻近的基质成纤维细胞中表达。有研究表明正常胰腺和PDAC组织之间的GPC1水平差异无统计学意义，但PDAC患者的循环外泌体(circulating exosomes, crExos)中GPC1水平较高[1]，提示外泌体中的GPC1蛋白可用于PDAC的早期检测。Melo等[7]通过研究乳腺癌、PDAC和健康供体患者血清中分离的crExos，发现GPC1阳性表达患者的crExos与癌症之间存在强烈的相关性，特别是对于PDAC。进一步研究发现在胰腺癌患者血清crExos中检测到GPC1，对诊断胰腺癌具有极高的特异度和灵敏度，可将健康受试者和良性胰腺疾病患者与早期及晚期胰腺癌患者区分开来。研究认为GPC1阳性表达者的crExos可作为潜在的非侵入性诊断和筛查工具，用于检测早期阶段的胰腺癌。之后的研究同样发现GPC1蛋白在正常胰腺的外分泌部中不存在，但在PDAC中显著过表达，同时肿瘤细胞中GPC1的增加与AJCC分期无关，表明它可能是早期PDAC的优良检测标志物[8]。

除了GPC1蛋白，锌转运蛋白ZIP4同样可用于PDAC的检测。Jin等[9]发现外泌体ZIP4水平可用于区分恶性胰腺癌患者与良性胰腺疾病患者、胆道疾病患者和健康群体，良性胰腺肿瘤患者和胰腺炎患者的外泌体ZIP4水平也存在显著差异。

1．外泌体与抗药性：胰腺癌具有局部侵袭、早期转移和对治疗的高度抗性的特征，目前常规使用细胞毒性药物来治疗，吉西他滨是最常使用的药物。抗药性是治疗失败的主要原因，因此迫切需要有效的预测标志物以区分胰腺肿瘤患者并制定个体化治疗方案，从而实现最小化治疗抗性[10]。

Patel等[11]发现吉西他滨处理的胰腺肿瘤细胞能产生明显的抗药性，而这种抗药性大多是由肿瘤细胞的外泌体引起。进一步研究发现这类经吉西他滨处理的释放外泌体(gem-exo)的胰腺肿瘤细胞中超氧化物歧化酶2(superoxide demutase 2, SOD2)和ROS解毒基因(CAT)上调，而吉西他滨代谢基因脱氧胞苷激酶(deoxycytidine kinase, DCK)下调。SOD/CAT上调抑制基础和吉西他滨诱导的ROS产生，并部分促进化学抗性。外泌体递送的miR-155导致DCK下调，而当miR-155的功能受到抑制或DCK得以恢复时，gem-exo介导的化学抗性显著消除。这些发现证明了外泌体在介导胰腺肿瘤的获得性化学抗性中的新作用。同一时期，Mikamori等[12]进一步验证了吉西他滨的长期暴露会增加PDAC细胞中miR-155的表达，miR-155的增加诱导了外泌体的分泌，而外泌体将miR-155递送到其他PDAC细胞，miR-155又可通过促进抗凋亡活性来增强PDAC细胞的化学抵抗能力。对miR-155或外泌体分泌的靶向治疗可有效地减弱PDAC细胞的化学抗性，为吉西他滨治疗PDAC提供了新的靶点。

Fan等[10]研究了对吉西他滨抗性可变的3种胰腺肿瘤细胞系(PANC1、MIA PaCa-2和BxPC3)分离出的外泌体在这些细胞系中传递化学抗性的能力，发现具有化学抗性的PANC1细胞外泌体促进了MIA PaCa-2和BxPC3细胞产生吉西他滨抗性。进一步研究表明，外泌体EphA2的表达可以传递抗药性，这可能作为预测胰腺肿瘤治疗反应的微创生物标志物。

2．外泌体与药物递送：除了化学抗性，药物递送方式的低效率也是限制现有药物治疗功效的一个重要因素。Pascucci等[13]在2014年首次证明间充质基质细胞能够通过其分泌的膜微泡包装和递送活性药物，为抑制体外肿瘤生长提供了一种新的药物输送方法。外泌体作为无免疫原性的纳米级囊泡，在有效药物递送系统研究方面受到了极大的关注。Kanchanapally等[14]通过用阿霉素孵育胰腺癌细胞、胰腺星状细胞和巨噬细胞来实现外泌体的药物装载，用高效液相色谱分析法评估药物包装到外泌体中的功效，发现胰腺癌细胞释放的外泌体最高，且装载药物量也最多；而巨噬细胞衍生的外泌体显示出最高的抗肿瘤活性，提示外泌体的药物装载存在供体细胞特异性差异，这可能影响它们作为治疗性药物载体的效用。

1．外泌体核酸与胰腺肿瘤患者预后：Takahasi等[15]研究发现血浆外泌体miR-451a在术后复发的PDACⅡ期患者中上升最明显，且外泌体miR-451a与肿瘤大小和分期显著相关。高水平外泌体miR-451a患者的总存活率和无病存活率显著低于低水平miR-451a患者，认为血浆外泌体miR-451a水平可能是用于预测PDAC患者的复发和预后的有效微创生物标志物。但Goto等[3]却发现高ex-miR-21表达患者的总存活率明显短于低ex-miR-21表达患者，而ex-miR-191和ex-miR-451a不影响胰腺肿瘤患者的生存率。Li等[16]发现PDAC患者血浆外泌体miR-222高，与肿瘤大小和TNM分期显著相关，是PDAC患者生存的独立危险因素。而任潇凡和李志花[17]在研究中发现高表达的外泌体lncRNA CCAT1与胰腺癌的进展有潜在的联系，外泌体lncRNA CCAT1过表达与胰腺癌患者不良预后呈正相关，是影响胰腺癌患者不良预后的独立因素。

研究证明KRAS突变也与胰腺肿瘤的预后有关。Bernard等[18]收集了患者的液体活检样本，通过多变量分析发现外泌体来源的DNA(exoDNA)中KRAS的突变等位基因分数(mutant allele fraction, MAF)≥5%是无进展生存期和总生存期的重要预测因子。进一步分析了局限性PDAC患者的连续血液样品中exoDNA和循环肿瘤DNA(ctDNA)水平，发现新辅助治疗后exoDNA水平的增加与疾病进展显著相关，而ctDNA与预后无明显相关性。Allenson等[6]也发现超过1%的KRAS MAF是影响无病生存期的重要风险因素。

2．外泌体蛋白质与胰腺肿瘤患者预后：Melo等[7]通过评估术前和术后血清GPC1阳性表达的PDAC患者crExos水平，发现手术切除后crExos水平显著降低，进一步研究发现crExos水平与肿瘤负荷及手术前和手术后患者的存活相关，crExos的减少可作为预测疾病存活的独立特异性预后标志。Frampton等[1]发现PDAC手术切除后患者crExos的GPC1水平显著下降，且高crExos GPC1水平的患者具有更大的肿瘤负荷。Lu等[8]也发现GPC1是胰腺癌患者总生存率较低的重要危险因素，风险比增加1.82倍。在胰腺肿瘤发生过程中，GPC1异位表达并作为独立的不良预后因素。高水平的GPC1与较差的病理分化和较差的生物学行为相关。然而，Tanaka等[19]的研究结果却并未表明GPC1阳性病例与GPC1阴性病例之间的预后差异。考虑到GPC1是由胰腺癌前病变表达的，可能不参与胰腺癌晚期的恶性潜能，故认为GPC1蛋白表达与胰腺癌患者的总体存活率或无复发存活率无关。除GPC1，Sakaue等[20]还发现腹水提取的外泌体中高度糖基化的CD133可作为晚期胰腺癌患者预后较好的潜在生物标志物。

近几年外泌体在胰腺肿瘤发生、发展、抗药性、临床诊断及预后的研究中备受关注，外泌体中的高质量核酸与蛋白质更是研究热点。然而外泌体中低浓度的DNA和DNA突变影响了液体活检的灵敏度，缺乏区分癌症外泌体和正常外泌体的有效手段影响了液体活检的特异度，这个问题的解决还有待外泌体DNA分离技术的改进。GPC1蛋白的表达在胰腺癌早期检测方面也受到一定的限制，GPC1过表达的PDAC前体病变并不一定会发展成为胰腺癌，故确定GPC1表达水平的阈值以检测胰腺恶性肿瘤十分必要。综上所述，外泌体在胰腺肿瘤诊治方面具有巨大发展潜力，为胰腺肿瘤提供了新的诊疗思路和手段，但后续仍需大样本的研究进一步验证。

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