血清miR-224-5p在胰腺导管腺癌中的表达及其对临床诊断的意义

贾孝娟 张巍巍 李文利 姜大磊 谢方瑜 张一 付来琳 王尧 陈斌 宋敏 李静 解祥军

1青岛大学附属青岛市市立医院消化内科，青岛 266011；2青岛大学附属青岛市市立医院心内科，青岛 266011；3青岛大学附属青岛市市立医院肝胆外科，青岛 266011；4青岛大学附属青岛市市立医院内窥镜室，青岛 266011

PDAC是胰腺癌中最常见的亚型，占所有胰腺肿瘤的85%[1]。由于胰腺位置隐匿，早期症状不典型[2]，近80%的患者在确诊前就已发生局部浸润或远处转移，因此识别潜在敏感的生物标志物对PDAC早期诊断至关重要。研究发现，PDAC患者血清中存在miRNAs表达谱的异常，且比蛋白质标志物出现得更早，提示循环miRNAs可能对PDAC的早期诊断具有重要意义[3-4]。miR-224-5p(miR-224)是miRNAs家族的一员，可作为结直肠癌、肝细胞癌等诊断的替代和无创生物标志物之一[5-6]。文献报道[7-9]，PDAC组织的miR-224-5p异常高表达，且常出现于PDAC的早期。本研究检测PDAC患者血清miR-224-5p表达，探讨其对胰腺癌早期临床诊断的价值。

资料与方法

一、一般资料

收集青岛市市立医院2018年8月至2020年4月间收治的40例PDAC患者。其中男性25例，女性15例，年龄(64±9)岁。按第8版AJCC分期将患者分为早期PDAC组(11例)和中晚期PDAC组(29例)。纳入标准：临床病理资料完整；EUS-FNA或手术切除术后组织及细胞病理检查确诊为PDAC。排除标准：慢性胰腺炎及PDAC癌前病变；有其他恶性肿瘤病史；伴有急性感染、肝炎、冠心病、脑梗死等严重疾病；采集血样前患者接受过手术、化放疗、介入等其他治疗。

收集同期21例慢性胰腺炎患者作为胰腺良性疾病对照组，其中男性10例，女性11例，年龄(61±8)岁。招募体检的40名健康志愿者作为健康对照组(无肝胆或胰腺疾病史、无其他系统疾病、无恶性疾病)，其中男性19例，女性21例，年龄(61±7)岁。慢性胰腺炎患者及健康对照者与PDAC患者在年龄、性别等方面具有可比性，差异无统计学意义。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

二、方法

所有入组对象抽血前3 d限制脂肪、蛋白等饮食，采集外周静脉血3 ml，离心后取上清液，移入2 ml无RNA酶的EP管中，置于-80℃冰箱保存备用。

采用Trizol试剂(北京天根生化科技有限公司)提取血清总RNA，紫外分光光度法测定样本总RNA的浓度和纯度，A260/280在1.8～2.1之间。应用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(广州复能基因有限公司，QP013)行逆转录反应生成 cDNA。采用定量PCR试剂Green Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa公司，RR820A)配制反应混合液。然后把加好样品的96孔板放在ABI 7500型荧光定量PCR仪中进行qPCR反应。miR-224-5p正向引物序列为5′-TCAAGTCACTAGTGGTTCCGTTTAG-3′，反向引物序列为5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；内参U6正向引物序列为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列为5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。PCR反应条件：95 ℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 34 s，共循环40次。由仪器自带软件获取样本Ct值，按照公式2-△△Ct计算miR-224-5p相对表达量，每个样品设3个复管，取均值。

CA19-9检测试剂购自上海罗氏诊断产品有限公司，上全自动化学发光免疫分析仪(Roche)cobas 8000检测。

三、统计学处理

结 果

一、PDAC组与慢性胰腺炎组及健康对照组血清miR-224-5p水平比较

早期PDAC组、中晚期PDAC组、慢性胰腺炎组和健康对照组血清miR-224-5p水平分别为3.21(2.01，4.60)、4.70(3.50，8.26)、1.72(1.02，2.78)、1.38(0.89，2.11)，中晚期PDAC组血清miR-224-5p水平显著高于早期PDAC组，早期PDAC组又显著高于慢性胰腺炎组和健康对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而慢性胰腺炎组与健康对照组的差异无统计学意义。

二、miR-224-5p、CA19-9诊断PDAC的临床价值

血清miR-224-5p、CA19-9诊断PDAC及早期PDAC的灵敏度、特异度的差异均无统计学意义。miR-224-5p联合CA19-9诊断PDAC的总灵敏度为92.5%～95.0%，高于CA19-9(P值分别为0.037、0.046)，对早期PDAC的诊断灵敏度为90.0%～90.9%，略低于总灵敏度，但高于单CA19-9(P值分别为0.044、0.041)及miR-224-5p(P值分别为0.038、0.023)；特异度为71.4%～72.5%，差异无统计学意义。从高到低，3者对PDAC及早期PDAC的诊断灵敏度依次为miR-224-5p+CA19-9、miR-224-5p、CA19-9，特异度依次为CA19-9、miR-224-5p、miR-224-5p+CA19-9(表1、图1)。

表1 miR-224-5p、CA19-9诊断胰腺导管腺癌的受试者工作特征曲线分析

图1 miR-224-5p、CA19-9诊断PDAC、早期PDAC的受试者工作特征曲线。1A PDAC组比健康对照组；1B PDAC组比慢性胰腺炎组；1C 早期PDAC组比健康对照组；1D 早期PDAC组比慢性胰腺炎组

三、PDAC患者血清miR-224-5p水平与肿瘤临床病理参数的关系

PDAC患者血清miR-224-5p表达水平与患者年龄、性别、肿瘤位置及大小无显著相关性(P值均>0.05)，而与TNM分期、淋巴结转移和远处转移相关(表2)。

讨 论

PDAC侵袭性高、进展性快，预后极差。目前诊断PDAC较为可靠的循环标志物为血清CA19-9[10]，但其灵敏度60%～90%，特异度68%～ 91%，假阴性及假阳性率较高，作为早期检测标志物的价值有限[11]。microRNAs是一类由19～23个核苷酸组成的非编码单链RNA，参与细胞增殖、蛋白质代谢和肿瘤发展等生理和病理过程[12]。它们具有高度保守性、特殊稳定性和组织特异性，易于在体液中获得。文献报道，miR-224-5p是一种致癌miRNA，在胃癌[13]、结直肠癌[14]、肝癌[15]、食管鳞癌[16]等消化系统肿瘤的表达明显高于非肿瘤组织。Mazza等[17]、Vila-Navarro等[18]报道PDAC高表达miR-224-5p。高侵袭性和转移性PDAC组织的miR-224-5p表达显著增高[7-8]。miR-224-5p可通过直接靶向下调PDAC细胞表面CD40蛋白表达，增强PDAC的侵袭和转移[7]；通过抑制PDAC细胞Aspc-1和BxPC3的生长、侵袭和迁移，增加细胞早期凋亡[8]；通过直接与其3′-非翻译区结合而逆向调节相互作用蛋白TXNIP，激活诱导因子HIF1α，从而促进PDAC的恶性进展[19]。近来研究还发现，miR-224-5p可靶向抑制前蛋白转化酶PCSK9诱导胰腺癌细胞BON-1凋亡[20]，miR-224-5p作为区室特异性调节剂，在PDAC细胞基质中及癌症相关的成纤维细胞中过表达，从而诱导了激活的表型、促进肿瘤的进展[9]。上述研究表明miR-224-5p参与了PDAC的发生和发展，且有望通过靶向相关基因和途径成为PDAC潜在的治疗靶点[21]。

表2 胰腺导管腺癌患者血清miR-224-5p水平与临床病理特征的关系

本研究结果显示，PDAC患者血清miR-224-5p水平较慢性胰腺炎患者及健康对照者显著上调，且诊断灵敏度高于CA19-9，可作为PDAC诊断的循环生物标志物。通过进一步评估对早期PDAC诊断价值，结果显示两者联合检测的诊断灵敏度高于单独CA19-9或miR-224-5p，特异度与单独miR-224-5p或CA19-9检测相似，提示miR-224-5p联合CA19-9检测对早期PDAC诊断有较高的临床应用价值。

本研究结果还显示，PDAC患者血清miR-224-5p水平与肿瘤TNM分期、淋巴转移和远处转移呈正相关(P值均<0.05)，提示血清miR-224-5p可能在PDAC细胞的增殖和迁移中起重要作用。

综上所述，miR-224-5p在PDAC患者尤其是在早期PDAC患者血清水平明显上调，miR-224-5p或联合CA19-9诊断价值优于单独CA19-9检测，且血清样本容易获取，因此miR-224-5p可能作为PDAC早期诊断的一项敏感的循环生物标志物。本研究不足之处为样本量较小，需要扩大样本量进一步验证。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突