高糖状态通过升高缺氧诱导因子-1α促进胰腺癌的侵袭能力

秦涛 肖莹 刘晗 黎韡 仵正 王铮 马清涌 马吉光

1西安交通大学第一附属医院肝胆外科，西安 710061；2山东大学齐鲁医院肝胆外科，济南 250012；3西安交通大学第一附属医院麻醉科，西安 710061

糖尿病与多种肿瘤的发生及发展密切相关[1-5]。实体肿瘤在发生、发展过程中局部微环境最显著的变化是缺氧，肿瘤细胞也通过改变代谢方式和增加抗氧化应激能力等适应缺氧环境，因此缺氧与肿瘤的血管形成、肿瘤细胞的浸润转移、术后复发及化疗耐药等恶性进展密切相关[3]。研究表明，糖尿病是胰腺癌的危险因素同时也是胰腺癌的促进因素[6]，也有报道认为糖尿病是胰腺癌的早期临床表现之一，血糖升高是胰腺癌所引起的后果[7]。胰腺癌处于缺氧微环境，这一状态与其高侵袭特征密切相关[8]。另一方面，胰腺癌合并糖尿病因高糖状态使血管内皮功能下降、血管内皮细胞损伤、毛细血管基底膜增厚等微循环系统结构改变，不仅造成胰腺组织内的灌流量下降，血供氧供减少，同时还引起氧气弥散功能下降，进一步加重组织缺氧。缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)是维持细胞和全身氧稳态的重要调节分子，缺氧条件下肿瘤通过HIF-1α调节糖代谢、血管形成、细胞增殖和组织重建，从而促进其细胞增殖、凋亡、血管生成、代谢和化疗耐药等作用[9]。本研究通过胰腺癌临床病理资料分析及建立糖尿病裸鼠胰腺原位移植瘤模型，探讨糖尿病状态下胰腺内的高糖和缺氧微环境促进胰腺癌细胞侵袭能力的可能机制，对现有的糖尿病促进胰腺癌理论进行支持和补充。

资料与方法

一、研究对象

收集2012年1月至2014年12月间西安交通大学第一附属医院46例行胰腺癌手术切除患者临床资料，其中男性25例，女性21例，年龄(54±12)岁。按照测得的空腹血糖水平分为血糖正常组(≥3.9 mmol/L～<6.1 mmol/L)28例和高血糖组(≥6.1 mmol/L)18例。记录患者的肿瘤体积，有无胆管、血管侵犯，胰周脂肪组织浸润程度，淋巴结转移等情况。

二、胰腺癌组织HIF-1α表达检测

采用常规免疫组织化学染色检测胰腺癌组织的HIF-1α表达。HIF-1α一抗购自美国Abcam公司，工作浓度1∶100，二抗购自美国Pierce公司，工作浓度1∶1 000，最后DAB显影，苏木精复染，梯度乙醇脱水后中性树脂封片，由病理科医师显微镜下阅片。并使用Image J软件中的IHC Profiler插件进行定量评分，强阳性(+++)为4分，阳性(++)为3分，弱阳性(+)为2分，阴性(-)为1分。HIF-1α阳性表达越高，则组织的缺氧状态越严重。

三、糖尿病裸鼠胰腺原位移植瘤模型的构建

从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买20只4～6周龄的雌性裸鼠，体重20 g左右。普通饲养适应1周后将裸鼠随机分为高血糖组和血糖正常组，每组10只。制模前禁食16 h，采用腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)200 mg/kg (即0.2 ml/10 g)的方法制备糖尿病模型。1周后测裸鼠血糖，以连续两次血糖≥20 mmol/L且尿糖阳性为标准判断糖尿病模型是否构建成功。

人胰腺癌细胞株BxPC3(中度分化)购于中科院上海细胞生物研究所，常规复苏传代。取107个对数生长期BxPC3细胞接种于正常裸鼠皮下，待皮下瘤形成后处死荷瘤鼠，皮肤消毒，取出肿瘤，剪成1 mm3的肿瘤组织块，浸入生理盐水中备用。腹腔注射4%水合氯醛溶液(0.01 ml/g)对上述高血糖组和血糖正常组裸鼠进行麻醉后，皮肤常规消毒，于左上腹部行1 cm的纵行切口，暴露胰腺，剪开胰腺被膜，将1 mm3的瘤块植入胰腺实质内后缝合固定。6周后处死裸鼠，切取胰腺原位移植瘤，测肿瘤体积(V)[V(cm3)=1/2× 长(cm)×宽(cm)×宽(cm)]，并观察肿瘤侵犯和转移情况。

四、裸鼠原位移植瘤内缺氧状态检测

Hypoxyprobe-1是一种硝基咪唑类化合物，其化学成分是派诺咪唑，近年来被开发利用作为乏氧标志物，用于检测组织的缺氧状态，其原理是利用还原硝基有选择性结合乏氧细胞的能力，从而形成的一种从细胞水平测定肿瘤乏氧的技术[10]。裸鼠处死前1 h，腹腔注射10 mg/ml的Hypoxyprobe-1液(6 μl/g)，处死裸鼠后获取移植瘤标本，按Hypoxyprobe-1试剂盒(美国Hpi公司)说明书操作，即使用试剂盒中FITC耦联的抗派诺咪唑的小鼠IgG单克隆抗体(FITC-MAb1抗体)孵育组织切片，通过搭配小鼠lgG-HRP二抗(美国Pierce公司)，运用免疫组织化学方法检测Hypoxyprobe-1积聚区域面积来判断移植瘤组织缺氧程度。

五、胰腺癌BxPC3细胞的分组

体外培养胰腺癌BxPC3细胞，分为常规培养组(对照组)、高糖培养组(高糖组)、缺氧培养组(缺氧组)、高糖+缺氧组以及靶向HIF-1α的siRNA转染组(siRNA-HIF-1α组)、高糖+siRNA-HIF-1α组，阴性对照siRNA转染组(siRNA-NC组)和高糖+siRNA-NC组。

高糖组细胞用含25 mmol/L葡萄糖的RPMI 1640培养液培养，缺氧组细胞用150 μmol/L的二氯化钴(CoCl2)干预(美国Sigma公司)，因为CoCl2中的二价钴离子可通过竞争结合脯氨酸羟化酶(proline hydroxylase，PHD)中的二价铁离子位点，抑制常氧状态下 PHD 活性，可模拟缺氧状态。

siRNA委托上海GenePharm公司设计与合成。siRNA-HIF-1α引物正向序列为5′-CCACCACUGAUGAAUUAAATT -3′，反向序列为5′-UUUAAUUCAUCAGUGGUGGTT-3′，siRNA-NC引物正向序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3′，反向序列为5′-ACGUGACAGGUUCGGAGAATT -3′。采用脂质体LipofectamineTM3000(美国Invitrogen公司)将siRNA-HIF-1α、siRNA-NC分别转染BxPC3细胞，按照说明书操作，转染后6 h更换新鲜培养液继续培养。高糖+缺氧组及高糖+siRNA-HIF-1α组则将缺氧组或siRNA-HIF-1α组细胞换成用高糖培养液培养。

六、胰腺癌BxPC3细胞基质金属蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9, MMP-9)和HIF-1α表达检测

收集各组对数生长期BxPC3细胞，采用RIPA裂解液(中辉赫彩公司)抽提细胞总蛋白，BCA法定量蛋白，调整浓度后常规行蛋白质免疫印迹法检测蛋白表达，以β-actin作为内参。MMP-9、β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司，HIF-1α抗体购于美国Abcam公司，过氧化物酶标记山羊抗小鼠、抗兔二抗均购于美国Pierce公司。最后ECL发光，X线曝光、显影、定影。采用凝胶图像软件分析系统扫描图像，以目的条带与内参条带的灰度值比表示蛋白相对表达量。

七、统计学处理

结 果

一、血糖正常组和高血糖组胰腺癌患者肿瘤侵袭转移及瘤体体积比较

与血糖正常组比较，高血糖组胰腺癌患者的胰周脂肪组织浸润率(66.7%比57.1%)、血管侵犯率(50%比42.9%)和淋巴结转移率(27.8%比14.3%)均升高，但两组差异无统计学意义(P值均>0.05)。高血糖组胰腺癌患者的肿瘤长径[(2.95±0.73)cm 比(2.09±0.70)cm]和胆管侵袭率(22.2%比0)均显著高于血糖正常组，差异有统计学意义(P值均<0.05)，提示高血糖能促进肿瘤的生长及侵袭能力。

二、血糖正常组和高血糖组胰腺癌患者肿瘤组织HIF-1α表达比较

46例胰腺癌组织均有HIF-1α的表达，其中+ 18例(39.1%)，++17例(47.0%)，+++ 11例(23.9%)。18例高血糖组患者癌组织HIF-1α + 5例(27.8%)，++ 5例(27.8%)，+++ 8例(44.4%)；28例血糖正常组患者癌组织HIF-1α+ 13例(46.4%)，++ 12例(42.9%)，+++ 3例(10.7%)，高血糖组患者胰腺癌组织HIF-1α强表达比例高于血糖正常组，两组间HIF-1α的表达强度差异有统计学意义(Z=-2.104，P=0.035)，提示高血糖能上调HIF-1α表达，加重胰腺癌缺氧的程度。

三、裸鼠胰腺原位移植瘤的缺氧状态及肿瘤的恶性行为

高血糖组裸鼠胰腺原位移植瘤的Hypoxyprobe-1积聚区域面积显著大于血糖正常组(图1)，差异有统计学意义[(43.2±2.4)%比(13.5±1.3)%，t=24.33，P<0.01]；原位移植瘤的体积[(1.82±0.88)cm3比(0.75±0.21) cm3，t=19.17]及发生肝转移的比例(5/10比0/10)显著高于血糖正常组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)。高血糖组出现腹水的裸鼠只数多于血糖正常组(6/10比1/10)，但差异无统计学意义，提示高血糖能加重裸鼠胰腺移植瘤的缺氧状态，促进肿瘤的生长及转移。

图1 血糖正常组(1)和高血糖组(2)裸鼠胰腺原位移植瘤的缺氧探针Hypoxyprobe-1(1A、1B)和HIF-1α(1C、1D)表达(×100)

四、各组胰腺癌BxPC3细胞MMP-9和HIF-1α蛋白表达的变化

高糖组、缺氧组BxPC3细胞MMP-9和HIF-1α蛋白表达水平均显著高于对照组(t值分别为37.97、48.99，36.74、48.99)，高糖+缺氧组BxPC3细胞的MMP-9和HIF-1α蛋白表达水平又显著高于其他3组(t值分别为80.56、56.55、49.57，44.15、20.91、13.17)，差异均有统计学意义(P值均<0.05，图2，表1)。

图2 对照组(1)、缺氧组(2)、高糖组(3)和高糖+缺氧组(4)BxPC3细胞MMP-9和HIF-1α蛋白表达(蛋白质印迹法)

表1 各组胰腺癌BxPC3细胞MMP-9和HIF-1α蛋白表达的比较

siRNA-HIF-1α组MMP-9和HIF-1α表达量显著低于其他3组，高糖+siRNA-HIF-1α组MMP-9和HIF-1α的表达量显著低于高糖+siRNA-NC组，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表2，图3)，提示抑制HIF-1α可下调MMP-9表达，而高糖可上调MMP-9和HIF-1α表达。

表2 各组胰腺癌BxPC3细胞MMP-9和HIF-1α蛋白表达的比较

图3 siRNA-NC组(1)、高糖+siRNA-NC组(2)、siRNA-HIF-1α组(3)和高糖+siRNA-HIF-1α组(4)BxPC3细胞MMP-9和HIF-1α蛋白表达 (蛋白质印迹法)

糖尿病是胰腺癌的危险因素，不仅可增加患者罹患胰腺癌的风险[6]，并且对已发生的胰腺癌具有明显的促进作用[11]，胰腺癌患者的餐后血糖升高水平与其病死率呈剂量依赖性关系。最近一项前瞻性研究表明，患有糖尿病的患者罹患胰腺癌的风险是无糖尿病患者的两倍，且血糖每增加1 mmol/L，胰腺癌的发病率升高15%[12]。对于可切除胰腺癌患者，如长期患有糖尿病，其病死率增加[13]。本课题组前期体外研究结果显示，高糖微环境通过GDNF/RET及EGF/EGFR信号通路促进胰腺癌细胞的增殖[14-15]。本研究结果显示，伴有糖尿病的胰腺癌患者出现胰周脂肪组织浸润、血管侵犯以及胰周淋巴结转移的例数、肿瘤生长速度、肿瘤胆管侵犯例数均大于血糖正常组，表明糖尿病可促进胰腺肿瘤的生长及增强其侵袭和转移能力。

由于肿瘤生长过快等多种因素的影响，实体瘤普遍存在缺氧状况。缺氧微环境是胰腺癌显著特征之一，与肿瘤的进展、侵袭转移及化疗敏感性等密切相关[16]。HIF-1α是细胞对氧浓度变化的主要调节因子。缺氧条件下，HIF-1α稳定性增加，降解减少，在细胞中表达增加，并转移到细胞核内与靶基因的缺氧反应原件结合，调节靶基因的转录[17]，从而影响肿瘤的发生和发展。研究表明，HIF-1α可以通过影响上皮间质转变相关基因的表达来调控肿瘤的侵袭迁移过程。已有研究证实，高血糖可以诱导细胞缺氧和线粒体活性氧的生产[18]。本研究结果显示，46例胰腺癌组织中均有HIF-1α的表达，且伴有高血糖的胰腺癌组织HIF-1α表达水平显著高于血糖正常状态下的胰腺癌。同样在裸鼠胰腺癌原位移植瘤中，高糖组裸鼠的移植瘤组织内HIF-1α表达上调，缺氧状况更加明显，也表明高血糖可以促进裸鼠胰腺癌原位移植瘤的生长并增强其侵袭和转移的能力。

MMP-9是基质金属蛋白酶家族的成员之一，其在肿瘤中高表达与肿瘤的迁移侵袭有关。本研究体外实验发现，高糖和缺氧都可以促使胰腺癌BxPC3细胞MMP-9和HIF-1α的表达水平上调，高糖和缺氧联合干预时MMP-9和HIF-1α的表达水平更加显著。采用RNA干扰技术沉默BxPC3细胞的HIF-1α基因表达后，高糖干预的BxPC3细胞的MMP-9表达水平降低。其原因可能是高糖状态通过上调HIF-1α的表达来促进胰腺癌细胞侵袭能力，抑制HIF-1α基因的表达，可弱化高糖状态对胰腺癌细胞侵袭能力的促进作用，但具体作用机制仍需进一步探索。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突