CD3/KIF20A双特异性抗体介导T淋巴细胞对KIF20A阳性胰腺癌PANC1细胞的抗肿瘤效应

贾原 张俊萍 薛昭君 杨晓玲 冯慧晶 刘鹏敏

山西医学科学院山西大医院肿瘤中心，太原 030032

肿瘤免疫治疗是一类以CD3+T淋巴细胞为主输注的治疗方法，因其不良反应小、特异性强等特点，被公认为是治疗胰腺癌的有效途径之一[1]。针对特异性细胞毒性T淋巴细胞(简称T细胞)的胰腺肿瘤抗原的筛选及鉴定成为学术界关注的热点[1-3]，而针对诱导特异性T细胞的肿瘤抗原的筛选及鉴定也受到学术界广泛的关注[3]。驱动蛋白家族成员20A(kinesin family menber 20A, KIF20A)作为一种肿瘤相关抗原，在胰腺癌细胞高表达而在正常细胞中不表达(或低表达)[4-6]，由此在胰腺癌的免疫治疗中具有很大的开发潜力[3]。有研究[7]将KIF20A与CD3单克隆抗体重组成双特异性抗体，通过同时识别KIF20A和CD3两个分子标靶，定向趋化迁移CD3+T细胞至KIF20A+肿瘤细胞，加强对肿瘤细胞的杀伤效应。此外，通过靶向同一种细胞上的两种不同受体，双特异性抗体可以诱导细胞信号的改变，包括癌症扩散信号或者炎症信号[8]。本课题组前期应用维生素C干预树突样细胞(dendritic cell, DC)-T细胞(DC-T细胞)[9-10]，本研究制备靶向KIF20A及CD3的双特异性抗体(CD3/KIF20A双抗)，并将其装载于维生素C干预的DC-T细胞，观察其对KIF20A+胰腺癌细胞的杀伤效应。

材料与方法

一、细胞系及主要试剂

胰腺癌细胞系PANC1购于美国模式培养集存库(American type culture collection，ATCC)，常规培养复苏。鼠抗人CD3单抗、 KIF20A单抗购自美国TaKaRa公司；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)检测试剂盒购自美国罗氏公司；CD3标记单抗、FITC标记CD28单抗、PE标记CD8单抗均购自美国BD公司；Traut′s试剂、 4-(N- 马来酰亚胺甲基)环己烷 -1- 羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(SULFO-SMCC)购自美国赛默飞世尔科技公司。

二、CD3/KIF20A双抗的制备及纯化鉴定

取1 mg人源CD3单抗溶于500 μl 0.5 mmol/L交联剂Traut′s试剂[11]，室温作用2 h，上Sephrose-G25凝胶层析柱，应用含20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT的洗脱液(pH 7.2)洗去多余的Traut′s试剂，获取人源CD3单链抗体；取1 mg人源KIF20A单抗，溶于500 μl 0.5 mmol/L交联剂Sulfo-SMCC，室温作用2 h，上Sephrose-G25凝胶层析柱，应用含20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、1 mmol/L DTT的洗脱液(pH 7.2)洗去多余的Sulfo-SMCC，获取人源KIF20A单链抗体；将上述CD3、KIF20A单链抗体混合，装入能透过分子质量<10 000的透析袋，置4℃透析18 h，平衡液为20 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl(pH7.2)。透析后在室温下上Sephrose-G25凝胶层析柱，应用平衡液洗脱，收集CD3/KIF20A双抗，再重复上凝胶层析柱过滤1次，收集纯化的双抗，经SDS-PAGE凝胶电泳鉴定后超滤浓缩，获得人源CD3/KIF20A双特异性抗体。

三、DC-T细胞培养及分组

抽取健康志愿者外周血20 ml，采用淋巴细胞分离液，以1 900～2 300r/min(离心半径15 cm)离心10～20 min分离出单核细胞层。吸取单核细胞，加30～50 ml淋巴细胞培养液常规培养过夜。次日将悬浮的细胞倒入另一个无菌细胞培养瓶用于培养T细胞，培养液中加入CD3单抗、1 000 U/ml IL-2，培养3～5 d；贴壁的细胞用于培养DC细胞，培养液中加或不加入1 mmol/L维生素C，培养3～5 d，分别获取维生素C干预的DC(vcDC)或DC。再将vcDC、DC分别与T细胞联合培养5～9 d，分别获取vcDC-T细胞及DC-T细胞。上流式细胞仪检测各组T细胞亚群及培养上清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-12水平。

四、CD3/KIF20A双抗装载的T细胞杀伤PANC1细胞的毒性试验

取对数生长期PANC1(KIF20A+)作为靶细胞，以5 000个细胞/孔接种于96孔培养板培养过夜；将10、50、100、300 ng双抗分别和1×105个T细胞混合作为效应细胞，以效靶细胞20∶1比例共同培养2、6、10 h，倒置显微镜下观察效应细胞对靶细胞的聚集效应，并应用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)法检测肿瘤细胞杀伤率，即在培养到时间点后用50 μl/孔的冷1640培养液中止反应，1 500 r /min(离心半径15 cm)离心5 min，收集上清，每孔加入100 μl LDH，室温避光孵育30 min后每孔加1 mol/L HCl 50 μl终止酶促反应，去除孔中含有的气泡，1 h内上酶标仪检测各孔波长490 nm处的吸光度值(A490值)，取3孔均值，计算T细胞对PANC1细胞的杀伤率，明确杀伤率最高的双抗装载剂量。细胞杀伤率(%)=[(实验组A490值-效应细胞A490值-靶细胞A490值)/(靶细胞最大A490值-靶细胞A490值) ]×100%。

然后以PANC1(KIF20A+)为靶细胞，以5 000个细胞/孔接种于96孔培养板培养过夜，以效靶细胞20∶1的比例分别加入DC-T细胞或装载对PANC1细胞杀伤率最高的双抗剂量的DC-T细胞及vcDC-T细胞，分别共同培养2、4、6、8、10、12 h，各设3个复孔。同样应用LDH法检测肿瘤细胞杀伤率。

五、统计学处理

结 果

一、化学交联CD3/KIF20A双抗的鉴定

经透析及2次Sepharose-G25柱过滤，通过SDS-PAGE凝胶电泳分离得到单一的CD3/KIF20A特异性双抗体蛋白条带，分子质量为130 000，双抗的产率约50%。

图1 各抗体的SDS-PAGE凝胶电泳图 1 分子量标记；2 CD3单抗；3 KIF20A单抗；4 透析后的CD3/KIF20A双抗；5 第1次G25柱过滤后的CD3/KIF20A双抗；6 第2次G25柱过滤后的CD3/KIF20A双抗； 7 浓缩后的CD3/KIF20A双抗

二、T细胞、DC-T细胞、vcDC-T细胞的亚群比例及细胞因子分泌水平

vcDC-T细胞组的CD8+CD28+及CD40L细胞亚群比例显著高于DC-T细胞组及T细胞组，而负性调节的Treg细胞亚群比例显著低于DC-T细胞组及T细胞组；IL-2、IFN-γ、IL-12的分泌量显著高于DC-T细胞组及T细胞组，而IL-4分泌量显著低于DC-T细胞组及T细胞组，差异均有统计学意义(P值均<0.05，表1)，说明维生素C干预不仅可以有效提升T细胞的功能，还可将过继免疫反应与天然免疫效应相结合。

三、T细胞、DC-T细胞、双抗DC-T细胞的靶向效应及对PANC1细胞的杀伤率

100 ng CD3/KIF20A双抗装载的DC-T细胞对KIF20A+胰腺癌PANC1细胞有明显的靶向性，显著地趋向PANC1相对集中的区域(图2)。

10、50、100、300 ng双抗装载的1×105个T细胞与PANC1细胞(20∶1)共培养2、6、10 h后对肿瘤细胞的杀伤率见图3，以装载100 ng双抗剂量的T细胞杀伤能力最强，装载率为1 000个细胞装载1 ng双抗。

表1 T细胞、DC-T细胞、vcDC-T细胞的亚群比例及细胞因子分泌水平

图2 PANC1细胞(2A)及DC-T细胞(2B)、100 ng CD3/KIF20A双抗装载的DC-T细胞(2C)对PANC1细胞的靶向聚集(×100)

图3 装载不同剂量双抗的T细胞对PANC1细胞的杀伤率

DC-T细胞、双抗DC-T细胞、双抗vcDC-T细胞与PANC1细胞(20∶1)共培养2、4、6、8、10、12 h对PANC1细胞的杀伤率见表2。双抗vcDC-T细胞对PANC1细胞的杀伤率高于双抗DC-T细胞，双抗DC-T细胞的杀伤率又高于DC-T细胞，3组间在不同共培养时间点的差异均有统计学意义。提示维生素C对双抗装载的T细胞起到增强细胞功能的作用，4 h时双抗vcDC-T 细胞组的杀伤率较双抗DC-T组提高20%以上，较DC-T组提高45%以上。

表2 DC-T细胞、双抗DC-T细胞、双抗vcDC-T细胞对PANC1细胞的杀伤率(%)

讨 论

随着全球环境的恶化和人们生活习惯的改变，肿瘤的发病率越来越高，肿瘤患者的病死率也逐渐上升，故抗肿瘤药物的市场将不断扩大[12]。双特异性抗体是抗体药物领域中的一个新概念，被视为肿瘤治疗的第二代抗体，拥有广阔前景。2014年6月一份研究报告显示[11]，2023年双特异性抗体药物的市场将达到44亿美元。近10年来，应用双特异性抗体来进行肿瘤治疗的研究已经取得了一定进展，多家生物医药公司也开展了多种相关药物的研发，有力地证明了双特异性抗体药物的有效性[13-14]。

KIF是一类具有轴突运输功能的分子马达，参与细胞分裂[6]，2005年首次发现其成员KIF20A在胰腺癌组织中高表达[4]。KIF20A是一种微管相关马达蛋白，其生物学功能主要参与细胞分裂，以及细胞器或细胞膜的转运等[5-6]。近期越来越多的研究发现 KIF20A的上调与癌症相关。一项胰腺癌Ⅰ/Ⅱ期临床研究[15]结果显示，选择HLA-A24限制性多肽治疗的9例胰腺癌患者中4例病情稳定，5例疗效不理想，疾病有效控制率达44%，表现出较高水平的抗瘤效应。另一项Ⅰ期试验[16]结果显示，入组的29例胰腺癌患者通过1个月多肽疫苗治疗后21例病情稳定，疾病有效控制率为72%，其中8例肿瘤缩小，1例病情完全缓解，中位生存期为142 d，无进展生存期为56 d，显示KIF20A作为治疗胰腺癌靶标具有良好的选择性和免疫原性。

本研究应用Trust′s试剂将CD3单抗和KIF20A单抗进行拆分后再拼接，再经过解耦联、分子筛、耦联、透析等方法获得双特异性抗体，产率近50%。表明通过选择商品化的单克隆抗体有明显的优势。但同时也显示化学耦联率有待提高，以增加双抗的产率。

本研究结果显示，经维生素C的干预[9-10]，vcDC-T细胞中的T细胞亚群比例得到优化，即CD8+CD28+、CD40L细胞比例增高，Treg细胞比例降低，同时T细胞的细胞因子分泌能力也明显提升，且IL-12的分泌水平显著改善，说明维生素C可将获得性过继免疫与天然免疫相结合。本研究进一步将双特异性抗体与维生素C刺激相结合，结果显示CD3/KIF20A双抗能增强DC-T细胞的靶向效应和对KIF20A+肿瘤细胞的杀伤能力，双抗结合维生素C刺激能进一步增强T细胞的靶向性及趋向性，增强T细胞的杀伤能力，并提高细胞因子的分泌能力，提高治疗肿瘤的效能。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突