血清纤维蛋白原β链水平对胰腺癌的临床诊断价值

吴红培 徐伟松 刘肇修 陈晓君 徐晓耘 纪易斐 江枫 鲍柏军 肖明兵,4

1南通大学附属医院消化内科，南通 226001；2南通市第二人民医院消化内科，南通 226002；3南通大学附属医院感染管理科，南通 226001；4南通大学附属医院临床医学研究中心，南通 226001

【提要】 采用自建的点免疫印迹法检测46例胰腺癌患者、58例胰腺良性疾病患者和46例健康体检者血清中纤维蛋白原β链(FGB)的水平。比较各组血清FGB水平，计算FGB诊断胰腺癌的灵敏度和特异度，分析FGB与胰腺癌患者临床病理参数的关系。结果表明胰腺癌组血清FGB水平显著高于胰腺良性疾病组及健康对照组，差异有统计学意义(P值均<0.05)。FGB独立诊断胰腺癌的临床价值与CA19-9、CEA相似，FGB联合CA19-9诊断胰腺癌有更高的灵敏度及特异度。胰腺癌患者血清FGB水平与肿瘤临床分期、淋巴结转移及远处转移相关(P值均<0.05)。

近年来，外泌体在肿瘤的早期诊断中备受关注，它是一种广泛存在于人体体液的纳米级囊泡，其携带着癌细胞相关的DNA、RNA和蛋白质等信息，在肿瘤的发生发展中起着重要的作用[1-2]。本课题组前期应用质谱技术在胰腺癌相关外泌体蛋白组学研究中发现多个差异表达蛋白，其中纤维蛋白原β链(fibrinogen β chain, FGB)在胰腺癌患者血清外泌体及去外泌体的上清液中水平均较高[3]。本研究进一步建立点免疫印迹法检测包括外泌体在内的血清总FGB水平，探讨其对胰腺癌的临床诊断价值。

一、资料与方法

1．研究对象：收集2016年12月至2018年11月南通大学附属医院及南通市第二人民医院收治的胰腺癌患者血清标本46例作为胰腺癌组，其中男性28例，女性18例，年龄35～78岁，中位年龄64岁。所有患者诊断均符合《胰腺癌综合诊治指南(2018年版)》[4]的标准，并按照美国NCCN 2017年第2版胰腺癌临床实践指南[5]进行临床分期。同时收集同期住院的胰腺良性疾病患者血清标本58例(急慢性胰腺炎33例，胰腺囊肿25例)作为胰腺良性疾病组，其中男性31例，女性27例，年龄28～89岁，中位年龄58岁。急性胰腺炎、慢性胰腺炎诊断均符合《急性胰腺炎诊治指南(2014年版)》[6]、《慢性胰腺炎诊治指南(2018年版)》[7]制定的标准。另外收集体检正常者血清标本46例作为健康对照组，其中男性20例，女性26例，年龄24～73岁，中位年龄53岁。

2．血清标本采集：采集所有入组者的清晨空腹外周静脉血3 ml，待血液自然凝固20 min后，离心分离血清，分装后立即储存于-80℃冰箱待测。

3．自建检测人血清FGB的点免疫印迹法：取健康对照组混合血清稀释成不同浓度梯度的对照样本，将待测样本及对照样本加样至硝酸纤维膜(NC膜)上，以NC膜上的蛋白质或多肽作为抗原，与相应的抗体发生免疫反应，再与辣根过氧化物酶标记的二抗反应，最后经底物显色，用Image J软件将图像扫描，以待测样本灰度值与对照样本灰度值比表示待测样本FGB水平。详细方法参考笔者申报的发明专利“一种点免疫印迹检测的检测装置及检测方法(申请号201910367764.7)”及已授权的实用新型专利“一种用于免疫印迹检测的新型检测装置(专利号ZL201920627384.8)”。

4．CA19-9及CEA的检测：采用电化学发光免疫分析法分别检测各组患者血清CA19-9、CEA的水平，试剂盒购自美国雅培公司，检测过程严格按照说明书进行。

5．统计学处理：用SPSS 20.0软件进行数据分析。点免疫印迹法测得的FGB水平均呈非正态分布，以M(P25,P75)表示，3组间比较采用Kruskal-Wallis检验，组内两两比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料以例(%)表示，FGB 水平与临床病理参数的相关性比较采用秩和检验。绘制FGB、CA19-9、CEA的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve, ROC)，计算曲线下面积(area under cruve,AUC)，评价观察指标的诊疗效能。P<0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1．胰腺癌组、胰腺良性疾病组、健康对照组血清FGB水平比较：胰腺癌组、胰腺良性疾病组、健康对照组血清FGB水平分别为0.826(0.457，1.253)、0.535(0.219，0.918)、0.492(0.263，0.788)，胰腺癌组患者血清FGB水平显著高于胰腺良性疾病组患者及健康对照组，差异均有统计学意义(P值均<0.05)，而胰腺良性疾病组与健康对照组之间的差异无统计学意义(图1)。

图1 点免疫印迹法检测血清FGB示意图。a为不同浓度的健康对照组混合样本，b、c、d为同一胰腺癌患者样本的3个复孔，e、f、g为同一胰腺良性疾病患者样本的3个复孔，h、i、j为同一健康对照者样本的3个复孔

2．FGB、CA19-9、CEA及联合检测对胰腺癌的诊断价值：血清FGB、CA19-9、CEA诊断胰腺癌的ROC曲线见图2，AUC分别为0.821(95%CI0.736～0.906)、0.874(95%CI0.794～0.953)、0.763(95%CI0.669～0.857)，诊断界值(cut-off值)分别为0.277、39 U/ml、5.3 ng/ml。血清FGB诊断胰腺癌的灵敏度低于CA19-9及CEA，但特异度高于CA19-9及CEA。FGB联合CA19-9或CEA诊断胰腺癌灵敏度均达到90%以上，特异度在70%以上，以FGB联合CA19-9最优，灵敏度高达95.5%，特异度达79.1%(表1)。

图2 血清FGB、CA19-9、CEA诊断胰腺癌的ROC曲线

表1 血清FGB、CA19-9、CEA诊断胰腺癌的临床价值

3．胰腺癌患者血清FGB水平与临床病理参数的关系：点免疫印迹法检测的胰腺癌FGB水平与肿瘤临床分期、淋巴结转移、远处转移相关，而与患者的年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位无明显相关性(表2)。

表2 胰腺癌患者血清FGB水平与临床病理参数的关系

讨论胰腺位于腹膜后间隙，早期胰腺癌患者缺乏特异性的临床症状，因此胰腺癌的早期诊断非常困难。目前，寻找早期发现和早期诊断胰腺癌的标志物已引起广泛关注。

本课题组前期通过质谱技术对胰腺癌患者血清外泌体进行了蛋白组学分析，筛选出胰腺癌患者高表达的分子——FGB。人纤维蛋白原是一种由肝细胞合成的凝血蛋白，由3对多肽链通过29对二硫键连接而成的六聚体，分子质量为340 000[7]。纤维蛋白原3条肽链分别由簇集于4q28～4q31约50 kb区域内的3个独立基因纤维蛋白原α(FGA)、纤维蛋白原β(FGB)和纤维蛋白原γ(FGG)编码[8]。诸多研究表明高纤维蛋白原血症与恶性肿瘤关系密切，但目前机制尚不清楚。Dipasco等[9]研究认为肿瘤细胞可以直接产生大量的凝血因子，激活体内凝血系统，从而导致纤维蛋白原升高。还有研究表明人体内的肿瘤细胞可以刺激内皮细胞释放大量凝血相关的组织因子，激活体内凝血过程，导致内皮细胞释放纤溶酶，抑制纤维蛋白原的降解，使纤维蛋白原升高[10]。纤维蛋白原在胰腺癌中的表达如何，特别是胰腺癌患者血清FGB水平目前尚无文献报道。

本课题组前期研究发现胰腺癌患者外泌体及去外泌体上清液中FGB水平均较高，因此可以通过直接检测血清中FGB水平来验证前期的质谱结果。在此基础上，笔者建立了点免疫印迹法，这种方法虽然可能不如时间分辨免疫荧光法及化学发光法敏感性高，但它具有独特的优点，如费用低、用血量较少、不需特殊仪器、可直观反映血液中蛋白浓度等，最重要的是可将包括外泌体在内的所有血清蛋白吸附在NC膜上进行检测。本研究结果显示，胰腺癌患者血清FGB水平显著高于胰腺良性疾病患者及健康对照者，与质谱分析胰腺癌患者外泌体及去外泌体上清液的FGB结果相契合，表明本研究建立的点免疫印迹法可直接检测血清FGB水平。ROC曲线分析确定血清FGB水平的截断值为0.277时，诊断胰腺癌的灵敏度为65.2%，特异度为89.4%，与血清CA19-9、CEA、同样具有独立诊断胰腺癌的能力。血清FGB联合CA19-9诊断的灵敏度达到95.5%，特异度达79.1%，表明联合检测优于单项检测，为胰腺癌的诊断和治疗提供了广阔的前景。

本研究还分析了胰腺癌患者血清FGB水平与肿瘤临床病理参数的相关性，结果显示血清FGB水平与胰腺癌临床分期、淋巴结和远处转移相关，推测血清FGB与胰腺癌的恶性生物学行为有关，这有待进一步研究探讨。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突