携带人Endostatin基因的腺病毒治疗胰腺癌移植瘤

吕纯业 胡先贵 张怡杰 刘瑞 金钢 邵成浩

携带人Endostatin基因的腺病毒治疗胰腺癌移植瘤

吕纯业 胡先贵 张怡杰 刘瑞 金钢 邵成浩

目的观察携带人Endostatin基因的重组腺病毒载体Ad-hEnd对裸鼠胰腺癌移植瘤的治疗作用。方法将胰腺癌细胞株SW1990细胞皮下注射建立裸鼠移植瘤模型，随机分为Ad-hEnd组、报告基因LacZ重组腺病毒组(Ad-LacZ组)和对照组，每组8只。重组腺病毒200 μl瘤内注射，隔日1次，共4次。观察移植瘤的生长情况，免疫组化染色检测血管内皮生长因子(VEGF)的表达和微血管密度(MVD)，原位缺口末端标记法(TUNEL)检测肿瘤细胞凋亡。结果移植瘤成瘤率100%。治疗后4周，Ad-hEnd组、Ad-LacZ组和对照组移植瘤体积分别为(921.9±279.7)mm3、(2804.4±553.5)mm3和(3040.6±487.6)mm3；瘤重分别为(1.19±0.18)g、(2.38±0.42)g和 (2.41±0.47)g；VEGF表达阳性率分别为(36.3±7.1)%、(81.2±6.6)%和 (79.4±6.2)%；MVD分别为12±4、27±5和25±6；细胞凋亡率分别为(31.2±5.4)%、(9.4±4.9)%和(8.5±3.7)%。与Ad-LacZ组和对照组比较，Ad-hEnd组以上各项指标均有显著性差异(Plt;0.01)；Ad-LacZ组和对照组之间的差异无统计学意义。结论重组腺病毒介导的hEndostatin基因可抑制胰腺癌的生长和血管生成，促进肿瘤细胞凋亡，可用于胰腺癌抗血管生成的基因治疗。

胰腺肿瘤； 内皮抑素类； 腺病毒； 基因治疗

肿瘤的生长、浸润和转移均依赖于肿瘤新生血管的形成，因此，抑制肿瘤血管形成可作为肿瘤治疗的有效手段。胰腺癌并非是血管丰富的肿瘤，但其发生发展仍和血管生成密切相关。内皮抑素(Endostatin)是迄今发现的作用最强的内源性血管生成抑制剂[1]，本实验在成功构建了携带人Endostatin (hEndostatin)的重组腺病毒载体基础上，瘤体内注射治疗胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，为利用腺病毒介导的人hEndostatin基因进行抗胰腺癌血管生成治疗提供依据。

材料和方法

一、材料

pGEM-T-hEndostantin质粒由东方肝胆外科研究所薛惠斌博士构建(hEndostatin基因序列前加有M-成瘤蛋白信号肽，并经测序验证正确)，hEndostatin重组腺病毒载体(Ad-hEnd)由我们前期构建[2]。AdEasyTM载体系统试剂盒为Stratagene公司产品，BJ5183菌株和293细胞为腺病毒载体试剂盒所带，胰腺癌SW1990细胞系由长海医院消化内科屠振兴教授惠赠，DNA 限制性内切酶、T4DNA 连接酶为BioLabs公司产品，柱离心式小量胶回收试剂盒、DNA 抽提纯化试剂盒为Qiagen公司产品，PCR试剂为上海闪晶生物公司产品，抗血管内皮生长因子(VEGF)一抗为福建迈新公司产品，EnVision免疫组化试剂盒为Daco公司产品。

二、裸鼠皮下移植瘤模型的建立及治疗

健康纯种SPF级BALB/C 4周龄雌性裸鼠24只，购自中科院上海实验动物中心。对数生长期的SW1990细胞0.2 ml(4×106)注射于裸鼠背部右侧皮下，1周后根据裸鼠荷瘤体积的大小，按系统抽样法分为Ad-hEND组、LacZ重组腺病毒(Ad-LacZ)组和对照组，每组8只。5×109pfu/ml的重组腺病毒200 μl，沿肿瘤长径多点多方向瘤内注射，对照组注射等量的PBS，隔日1次，共4次。每周用游标卡尺测量肿瘤的长径(A)和短径(B)，肿瘤体积(V)=A×B2×0.52[2]。治疗4周后颈椎脱臼法处死裸鼠，切取肿瘤浸入等渗盐水漂洗干净，称重后常规固定、石蜡包埋、切片。

三、免疫组化染色

常规性免疫组化染色。镜检观察血管内皮生长因子(VEGF)的表达和微血管密度(MVD)。VEGF每组动物观察8张切片，每张切片随机取5个视野(10×40)，计算VEGF阳性肿瘤细胞占总细胞的百分数，取其均值。微血管计数采用文献[3]方法，记录4个视野内的微血管数，取其平均数。

四、原位缺口末端标记(TUNEL)法

肿瘤细胞凋亡采用TUNEL法。每张切片随机取3个阳性视野(10×40)，计数500个细胞，计算凋亡细胞百分率。

五、统计学方法

结 果

一、裸鼠皮下移植瘤的生长改变

接种SW1990细胞1周后，接种部位长出大小约58 mm3的肿瘤，成瘤率100%。各组裸鼠皮下移植瘤均进行性增大，但Ad-hEnd组移植瘤生长速度显著慢于其他2组(图1，表1)。治疗后4周，Ad-hEnd组移植瘤体积为(921.9±279.7)mm3，显著小于Ad-LacZ组的(2804.4±553.5)mm3和对照组的(3040.6±487.6)mm3(Plt;0.01)；Ad-hEnd组瘤重为(1.19±0.18)g，显著小于Ad-LacZ组的(2.38±0.42)g和对照组的(2.41±0.47)g (Plt;0.01)。Ad-LacZ组和对照组之间的差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

图1 各组裸鼠SW1990细胞皮下移植瘤的生长曲线

二、移植瘤组织VEGF表达的变化

各组移植瘤均表达VEGF(图2)，Ad-hEnd组移植瘤VEGF表达阳性率为(36.3±7.1)%，显著低于Ad-LacZ组的(81.2±6.6)%和对照组的(79.4±6.2)%(Plt;0.01)；Ad-LacZ组和对照组之间的差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

三、移植瘤MVD的变化

Ad-hEnd组移植瘤MVD为12±4，明显少于Ad-LacZ组的27±5和对照组的25±6(Plt;0.01)；Ad-LacZ组和对照组之间差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

四、移植瘤细胞凋亡率的变化

Ad-hEnd组移植瘤细胞凋亡明显增多，呈簇状分布，而Ad-LacZ组、对照组仅有散在分布的凋亡细胞(图3)。Ad-hEnd组移植瘤细胞凋亡率为(31.2±5.4)%，明显高于Ad-LacZ组的(9.4±4.9)%和对照组的(8.5±3.7)%(Plt;0.01)；Ad-LacZ组和对照组之间的差异无统计学意义(Pgt;0.05)。

表1 各组裸鼠SW1990细胞皮下移植瘤的体积和重量的变化

注：与其他2组比较，*Plt;0.01

图3 Ad-hEnd组(A)、Ad-LacZ组(B)和对照组(C)肿瘤的凋亡细胞(TENEL ×400)

讨 论

血管形成是恶性肿瘤生长和转移的基础，因此恶性肿瘤的治疗应针对两个不同的细胞群体：肿瘤细胞和血管内皮细胞。Endostatin是O′Reilly等于1997年从小鼠内皮瘤细胞的培养上清液中首次分离出来的，由胶原ⅩⅧ C末端单基因片断编码的184个氨基酸组成，是迄今发现的作用最强的内源性血管抑制因子，其重组蛋白已用于临床，但由于生产费用昂贵、需长期全身用药、治疗剂量大、操作复杂及可能产生不良反应等缺点，目前尚不能普及。Endostatin局部给药疗效优于全身给药[3]，若采用基因治疗的方式将目的基因转入肿瘤组织，使其可自分泌和(或)旁分泌血管抑制因子，不仅降低成本，还可在肿瘤局部造成药物的高浓度，增强治疗效果。

胰腺癌的血管生成也是血管调控因子失衡的结果[4]，可作为胰腺癌分化、转移和预后分析的指标[5]。下调肿瘤细胞内源性VEGF的表达是Endostatin抗肿瘤的机制之一[6-7]，导入外源基因上调内源性血管生成抑制因子的表达以拮抗VEGF的促进血管生成作用，能显著抑制胰腺癌的生长和转移。由于Endostatin抑制血管生成以及肿瘤的生长和转移均表现出明显的量-效依赖关系，因而有效的基因转移方法和转移基因的高效表达是Endostatin基因治疗的关键。质粒、脂质体等介导的Endostatin基因治疗虽然在动物实验中抑制了肿瘤生长，但由于转染效率不高，抑瘤效应比Endostatin重组蛋白要弱，而应用高效的病毒载体介导Endostatin基因转移的治疗效果显著优于重组蛋白[8]。

我们在前期研究中成功构建了携带人Endostatin的重组腺病毒载体(Ad-hEnd)，Western blotting分析证实目的基因可在肿瘤细胞内表达，所表达的hEndostatin蛋白显著抑制鸡胚尿囊膜血管生成，具有生物学活性。本实验结果显示，将Ad-hEnd注入胰腺癌移植瘤后显著抑制其生长，抑瘤率达54.14%，同时移植瘤组织中VEGF的表达下降，MVD减少，肿瘤细胞凋亡率增加，表明靶向Endstatin的基因治疗有一定疗效。但转染hEndostatin基因并不能完全抑制移植瘤生长，原因可能在于肿瘤血管形成受多种促进因子和抑制因子共同调节，胰腺癌细胞本身也能产生多种血管生成促进因子，hEndostatin基因转染难以完全拮抗其作用。有研究证实Endostatin能增强肺癌的化疗效果[9]，对化疗不敏感的胰腺癌是否具有相同的作用尚有待继续研究。

[1] O′Reilly MS,Boehm T,Shing Y,et al.Endostatin:an endogenous inhibitor of angiogenesis and tumor growth.Cell,1997,88:277-285.

[2] 吕纯业，胡先贵，邵成浩，等.重组腺病毒介导的人内皮抑素基因在SW1990细胞中的表达.中华实验外科杂志，2007，24：1220-1222.

[3] Ziu M,Carrabba G,Bello L,et al.Antiangiogenic therapy by local intracerebral microinfusion improves treatment efficiency and survival in an orthotopic human glioblastoma model.Clin Cancer Res,2004,10:1255-1262.

[4] Schuch G,Kisker O,Atala A,et al.Pancreatic tumor growth is regulated by the balance between positive and negative modulators of angiogenesis.Angiogenesis,2002,5:181-190.

[5] Stipa F,Lucandri G,Limiti MR,et al.Angiogenesis as a prognostic indicator in pancreatic ductal adenocarcinoma.Anticancer Res,2002,22:445-449.

[6] Hajitou A,Grignet C,Devy L,et al.The antitumoral effect of endostatin and angiostatin is associated with a down-regulation of vascular endothelial growth factor expression in tumor cells.FASEB J,2002,16:1802-1804.

[7] Fukumoto S,Morifuji M,Katakura Y,et al.Endostatin inhibits lymph node metastasis by a down-regulation of the vascular endothelial growth factor C expression in tumor cells.Clin Exp Metastasis,2005,22:31-38.

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[9] 黄纯，李凯，魏熙胤，等.晚期非小细胞肺癌循环血管内皮细胞水平的研究.中华肿瘤杂志，2006，10：780-783.

2008-08-21)

(本文编辑：屠振兴)

Humanendostatingenerecombinantadenovirusforpancreaticcarcinomainnudemice

LVChun-ye,HUXian-gui,ZHANGYi-jie,LIURui,JINGang,SHAOCheng-hao.

DepartmentofGeneralSurgery,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

SHAOCheng-hao,Email:schhao@133sh.com

ObjectiveTo construct a human endostatin adenovirus vector and investigate its inhibitory effect on pancreatic carcinoma in nude mice.MethodsAnimal model of pancreatic carcinoma bearing nude mice was established by subcutaneous injection of SW1990 cells. All mice were randomized into Ad-hEnd group, Ad-LacZ group and control group with 8 mice in each group. The endostatin gene recombinant adenovirus were intratumorally injected every two days for 4 times. The rate of tumor growth was observed. Immunohistochemical staining was employed to investigate the expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) and micro-vessel density (MVD). TUNEL in situ was used to examine tumor cell apoptosis.ResultsThe tumor formation rate was 100%. 4 weeks later, the volumes of the tumors were (921.9±279.7)mm3, (2804.4±553.5)mm3and (3040.6±487.6)mm3in Ad-hEnd group, Ad-LacZ group and control group, respectively; the weights of the tumors were (1.19±0.18)g, (2.38±0.42)g and (2.41±0.47)g, respectively; the VEGF positive rates were (36.3±7.1)%, (81.2±6.6)% and (79.4±6.2)%, respectively; the levels of MVD were 12±4, 27±5 and 25±6, respectively; the apoptotic rates were (31.2±5.4)%, (9.4±4.9)% and (8.5±3.7)%, respectively. Compared with Ad-LacZ group and control group, the parameters in Ad-hEnd group were statistically different (Plt;0.01). The difference between Ad-LacZ group and control group was not statistically different.ConclusionsHuman endostatin gene mediated by recombinant adenovirus could inhibit tumor growth, angiogenesis and promote cell apoptosis of pancreatic carcinoma and could be used as gene therapy for pancreatic carcinoma.

Pancreatic neoplasms; Endostatins; Adenoviruses; Gene therapy

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.007

国家自然科学基金(30200275)；上海市青年科技启明星计划(05QMX1472)

200433 上海，第二军医大学长海医院普外科

邵成浩，Email: schhao@133sh.com