Toll受体4在急性胰腺炎引起的血-脑脊液屏障通透性增高中的作用

丁震 刘俊 蔺蓉 钱伟 侯晓华

Toll受体4在急性胰腺炎引起的血-脑脊液屏障通透性增高中的作用

丁震 刘俊 蔺蓉 钱伟 侯晓华

目的研究Toll受体4(toll receptor-4，TLR-4)在急性胰腺炎(AP )合并中枢神经系统(CNS)损伤中的作用。方法将64只SD大鼠分为8组：对照组；急性水肿性胰腺炎(AEP)2、6 h组；急性坏死性胰腺炎(ANP)2、6、12、24、48 h组，每组8只。测定血-脑脊液屏障(BBB)通透性、胰腺病理损伤程度、组织TLR-4的表达，并分析其相互关系。结果对照组，AEP2、6 h组，ANP 2、6、12、24、48 h组的BBB通透性分别为1.55±0.29、1.64±0.17、1.69±0.24、1.89±0.12、2.66±0.32、2.91±0.29、2.89±0.69和1.84±0.07；胰腺病理分值分别为0、2.38±0.92、3.13±0.64、8.50±1.07、9.75±0.71、10.25±1.28、11.13±1.25和10.13±1.13。AEP组与对照组无显著差异，ANP各组较AEP组显著升高(Plt;0.05或Plt;0.01)。BBB通透性与胰腺损伤呈正相关(r=0.626,Plt;0.01)。对照组和AEP组无TLR-4 mRNA和蛋白表达，而ANP各组明显表达,其表达水平与BBB通透性水平呈正相关(r=0.208，P=0.027)。结论ANP时存在BBB通透性的升高，CNS内TLR-4信号途径的激活可能参与了ANP所引起的血-脑脊液屏障通透性的升高。

胰腺炎； 血脑屏障； 通透性； Toll样受体4

胰性脑病是急性胰腺炎(AP)的重要并发症，其临床发生率约3%～27%，病死率高达40%以上[1]。中枢神经系统(central nervous system，CNS)存在血-脑脊液屏障(blood brain barrier，BBB)，它能保护大脑免受外周致病因子的攻击，其损伤和通透性的升高是多种CNS炎症及病变的前提[2-3]。Toll 样受体4(Toll-like receptor 4, TLR-4)主要介导细菌内毒素(LPS)诱导的天然免疫反应,近年来的研究显示，BBB构成细胞表面存在TLR-4，并且其信号通路在许多无菌性炎症中也被激活，并发挥重要作用[4-5]。本实验观察BBB通透性在AP时的变化规律及与TLR-4表达的关系，探讨TLR-4在AP合并CNS损伤中的可能作用。

材料与方法

一、实验分组

健康SD大鼠64只，购自华中科技大学同济医学院实验动物中心，体重250～350 g。根据体重采取配偶随机分组法将动物分为8组：对照组；急性水肿性胰腺炎(AEP)2、6 h组；急性坏死性胰腺炎(ANP)2、6、12、24、48 h组。每组大鼠8只。采用许永春等[6]报道的改良胰胆管注射法制备大鼠AEP、ANP模型。并从胰腺水肿、白细胞浸润、出血、坏死4个方面分4个等级进行评分[7]。

二、BBB通透性测定

以透过BBB伊文蓝量的多少反映BBB的通透性。先制作标准曲线。大鼠处死前0.5 h注入2%伊文蓝溶液5 ml/kg体重。处死前心内插管灌注生理盐水，以冲掉血管内残存的伊文蓝。随后完整取出右侧大脑，称重后置入7.5 %三氯乙酸溶液中。匀浆、离心、取上清液，按1∶3的比例用乙醇稀释，测定其A620值，通过标准曲线计算其伊文蓝的含量。

三、TLR-4测定

1．免疫组化染色：处死大鼠并行4%多聚甲醛灌注，取大鼠中脑浸入4%多聚甲醛固定16～24 h，30%蔗糖脱水后冷冻切片，常规免疫组化染色。TLR-4一抗(santa cruz公司)工作浓度为1∶100，二抗采用兔源性抗体试剂盒(中杉金桥公司)。

2．RT-PCR：取新鲜大鼠大脑，常规抽提总mRNA，RT-PCR法测定TLR-4 mRNA的表达。根据GenBank公布的cDNA序列，利用Primer5软件设计引物，以β-actin作为内参照。TLR-4上游引物：5′-GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT-3′，下游引物：5′- ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT-3′，扩增产物356 bp。扩增产物电泳、扫描，以TLR-4条带与β-actin条带灰度值比作为TLR-4 mRNA的相对表达量。

四、统计学处理

BBB通透性与对照组比较采用独立t检验，相关性分析采用Pearson相关分析法，统计运算由SPSS11.0软件完成，Plt;0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、BBB通透性的变化及其与胰腺损伤的关系

对照组，AEP 2、6 h组，ANP 2、6、12、24、48 h组的BBB通透性分别为1.55±0.29、1.64±0.17、1.69±0.24、1.89±0.12、2.66±0.32、2.91±0.29、2.89±0.69和1.84±0.07。2个AEP组与对照组均无显著差异(Pgt;0.05)。与对照组比较，ANP组BBB通透性从2 h起开始升高(Plt;0.05)，12 h时达到高峰，并持续至24 h(Plt;0.01)，48 h才有所下降(Plt;0.05)。以正常值上限为1.84计算，ANP大鼠BBB通透性升高率为77.5%(31/40)。

对照组，AEP 2、6 h组、ANP 2、ANP 6、12、24、48 h组的胰腺病理分值分别为0、2.38±0.92、3.13±0.64、8.50±1.07、9.75±0.71、10.25±1.28、11.13±1.25和10.13±1.13，与BBB通透性呈正相关(r=0.626，Plt;0.01)。

二、TLR-4表达及其与BBB通透性的关系

对照组和2个AEP组大脑均未见TLR-4蛋白阳性表达，ANP各组均可见TLR-4蛋白表达，其表达部位主要位于血管壁(图1)，同样，TLR-4 mRNA 也仅在ANP各组表达(图2)。

各组TLR-4 mRNA相对表达量与BBB通透性呈明显正相关(r=0.208，P=0.027，图3)。

讨 论

血-脑脊液屏障是CNS的重要自我保护系统，而BBB的通透性升高及损伤则是CNS出现炎症性病变的前提[2-3]，因此我们认为，研究胰性脑病发病的关键在于研究血-脑脊液屏障的通透性变化及其影响因素。

本实验结果显示，AEP组BBB通透性与对照组无明显差异，均明显低于ANP组，这一点和临床上轻症急性胰腺炎患者一般无全身性的并发症相吻合。Farkasa等[8]曾经报道，大鼠静脉注射牛磺胆酸钠后出现BBB通透性升高，并于6 h时达到顶峰。本实验ANP大鼠BBB通透性达到高峰的时间为12 h，这可能是因为Farkasa等的实验没有设计ANP 12 h组的缘故。此外，本实验中BBB通透性升高率(77.5%)低于刘小丰等[9]报道的90%，这可能是因为后者造模是在血管内注射溶血卵磷脂，直接破坏BBB的缘故。

图1ANP组大脑组织TLR-4蛋白表达(免疫组化×1 000)图2各组RT-PCR扩增产物电泳图

图3TLR-4 mRNA表达与血-脑脊液屏障通透性的相关性

本次实验对造模大鼠的胰腺进行了病理评分，结果显示许永春等[6]报道的AEP造模方法切实可行。并且胰腺的病理评分与血-脑脊液屏障通透性改变直接相关，提示胰腺炎随着病情的加重，对CNS的影响也在增加，这与临床重症急性胰腺炎(SAP)容易导致多器官功能衰竭的规律相一致。

TLR-4由于在介导炎症反应信号转导中的重要作用而越来越受到重视，现有研究发现TLR-4在SAP及其并发症的发生发展中也有重要作用[10-12]。本实验显示TLR-4信号通路的激活仅仅发生在ANP，这和CNS并发症仅存在于SAP的临床特点相符合。TLR-4的表达主要位于血管周围，提示TLR-4的激活信号很可能来自于血液，因为在SAP时血液循环中存在TLR-4的激活因子如内毒素、热休克蛋白等。此外，TLR-4表达的量与BBB通透性的升高相一致，但对于两者间的相关是否为因果关系，我们还将在今后的实验中进一步研究。

综上所述，BBB通透性的升高与大鼠胰腺炎炎症程度直接相关，并且在大鼠ANP模型中为一常见表现，其发展呈现一定的时间依赖性。TLR-4作为重要的炎症信号传递分子， SAP时在CNS内表达水平明显升高，并且表达水平与BBB通透性的变化也相关，提示TLR-4信号通路参与了AP时CNS系统的病变。

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[7] 许永春，李兆申，屠振兴，等.单核细胞趋化蛋白在重症急性胰腺炎发病机制中的作用.胰腺病学，2004，4：94-97.

[8] Farkasa G,Martona J,Nagy Z,et al.Experimental acute pancreatitis results in increased blood-brain barrier permeability in the rat: a potential role for tumor necrosis factor and interleukin 6.Neurosci Lett,1998，242：147-150.

[9] 刘小丰,钱祝银,苗毅.外源性溶血卵磷脂对急性胰腺炎大鼠血脑屏障通透性的影响.中国普通外科杂志，2005，14：331-333.

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2008-04-03)

(本文编辑：屠振兴)

Roleoftollreceptor-4intheincreaseofbloodbrainbarrierpermeabilitycausedbyacutepancreatitis

DINGZhen,LIUJun,LINRong,QIANWei,HOUXiao-hua.

DepartmentofGastroenterology,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430022,China

HOUXiao-hua,Email:houxh@public.wh.hb.cn

ObjectiveTo investigate the relation between the expression of toll receptor-4 (TLR-4) and the increase of blood brain barrier (BBB) permeability in the rats with acute pancreatitis.MethodsMale Sprague-Dawley rats were randomly divided into 8 groups: control group; acute edematous pancreatitis (AEP) 2 h, 6 h groups; acute necrotizing pancreatitis (ANP) 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h groups with 8 rats in each group. The BBB permeability, pathological score of pancreas, TLR-4 expression were determined and the relationships between them were analyzed.ResultsThe BBB permeability in control group; acute edematous pancreatitis (AEP) 2 h, 6 h groups; ANP 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h groups were 1.55±0.29, 1.64±0.17, 1.69±0.24, 1.89±0.12, 2.66±0.32, 2.91±0.29, 2.89±0.69 and 1.84±0.07, respectively；the pathological scores of pancreas were 0,2.38±0.92, 3.13±0.64, 8.50±1.07, 9.75±0.71, 10.25±1.28, 11.13±1.25 and 10.13±1.13, respectively；there was no significant difference between AEP groups and control group, while there was significant difference between AEP groups and ANP groups (Plt;0.05 orPlt;0.01). BBB permeability was correlated with pancreatic injury (r=0.626,Plt;0.01). There was no TLR-4 mRNA and protein expression in the control and AEP group, while they were significantly expressed in ANP groups, and the expression were positively related with BBB permeability (r=0.208,P=0.027).ConclusionsBBB permeability was present in the course of ANP. Activation of TLR-4 signal pathway may be involved in the BBB permeability increase caused by ANP.

Pancreatitis; Blood-brain barrier; Permeability; Toll-like receptor 4

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.012

430022 湖北武汉，华中科技大学同济医学院附属协和医院消化内科

侯晓华，Email: houxh@public.wh.hb.cn