胰淀粉样多肽在糖尿病及胰腺癌患者胰腺组织中的表达

崔楠 邹大进

胰淀粉样多肽在糖尿病及胰腺癌患者胰腺组织中的表达

崔楠 邹大进

目的检测胰淀粉样多肽(IAPP)在胰腺癌患者胰腺组织中的表达,探讨胰腺癌与糖尿病的相关性。方法收集28例手术切除的胰腺癌及其相应癌旁正常胰腺组织，其中12例患者合并糖尿病，16例不合并糖尿病。采用免疫组化和蛋白质印迹法(Western blotting)检测组织标本中IAPP的表达。结果IAPP定位表达于人胰腺的胰岛细胞胞质内。合并糖尿病的胰腺癌组织及癌旁胰腺组织、不合并糖尿病的胰腺癌组织及癌旁胰腺组织IAPP表达的免疫组化指数分别为283 305±91 627、122 874±86 917、154 032±81 097和105 797±67 593；IAPP相对表达量分别为(173.1±23.5)%、(119.4±18.4)%、(148.7±28.3)%和100%。胰腺癌组织的IAPP表达均显著高于相应癌旁正常胰腺组织(Plt;0.01)；合并糖尿病的胰腺癌组织的IAPP表达显著高于不合并糖尿病的胰腺癌组织(Plt;0.01)；合并糖尿病的癌旁胰腺组织的IAPP表达高于不合并糖尿病的癌旁胰腺组织(Plt;0.05) 。结论IAPP 与糖尿病及胰腺癌的发病密切相关，很可能为两种疾病的共同发病机制之一。

胰腺肿瘤； 糖尿病，2型； 胰淀粉样多肽； 免疫组织化学； 印迹法，蛋白质

胰岛淀粉样多肽 (islet amyloid polypeptide，IAPP)，又称胰淀素(amylin),是进食后同胰岛素一起由胰岛β细胞分泌的肽类激素，是胰岛淀粉样蛋白沉积的主要和独特成分。尸检证实，50%～90%的2型糖尿病患者可发生胰岛淀粉样病变[1,2]。在2型糖尿病的猴子和猫的动物模型中，也发现了胰岛淀粉样病变[3,4]，但在小鼠和大鼠中则无此现象，表明胰岛淀粉样病变与动物种属有关。也有研究表明[5]，合并糖尿病的胰腺癌患者血浆IAPP的浓度明显高于正常人及其他肿瘤患者，但IAPP在人胰腺组织及胰腺癌组织中的表达鲜见报道。因此，我们检测IAPP在胰腺癌组织和癌旁胰腺组织中的表达及其与血糖的关系，探讨IAPP在胰腺癌合并糖尿病发生中的作用。

材料与方法

一、组织标本

所有标本均取自2006年10月至2007年5月第二军医大学附属长海医院普外科手术切除的28例胰腺癌组织及相应癌旁正常胰腺组织，标本均经病理学确诊,均有完整的手术记录资料及临床资料，所有患者均术前签署知情同意书。12例患者合并糖尿病(符合1999年WHO 2型糖尿病诊断标准)，16例患者血糖正常。分为合并糖尿病的胰腺癌组织、合并糖尿病的癌旁胰腺组织、不合并糖尿病的胰腺癌组织及不合并糖尿病的癌旁胰腺组织4组。

二、IAPP检测

采用ABC法检测。兔抗人Amylin单克隆抗体(Serotec公司)1∶100稀释，生物素标记二抗及辣根酶标记链霉卵白素相继室温孵育后DAB显色。应用MIQAS医学图像定量分析系统、 医学图像定量分析软件分析视野中阳性区域面积以及光密度(A)值，两者乘积为免疫组化指数。每张切片分析3个视野。

同时采用蛋白质印迹法(Western blotting)半定量测定IAPP的表达。新鲜胰腺癌及癌旁正常胰腺组织制备匀浆，12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳后，按Amersham Phamacia公司Hybond ECL操作说明进行转膜。加入兔抗人Amylin多克隆抗体(Abcam公司)和辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶25 000稀释)，最后ECL发光。用Quantity One图像分析软件(Bio-Rad)灰度扫描X线胶片。以β-actin作为内参照，目的蛋白相对表达量以目的蛋白与β-actin灰度值之比表示。将不合并糖尿病的癌旁正常胰腺组织的目的条带相对表达量设为100%，计算其他各组与其的比值。

三、统计学处理

结 果

一、一般临床资料

12例合并糖尿病的胰腺癌患者，糖尿病史(2.1±0.8)年，HbA1c 8.36±2.4，其中男8例，女4例，年龄(59±8)岁，体重指数(23.6±3.1)kg/m2，收缩压(129±16)mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，舒张压(84±8)mm/Hg，三酰甘油(1.42±0.53)mmol/L；16例不合并糖尿病的胰腺癌患者，男6例，女10例，年龄(59±6)岁，体重指数(22.9±2.9)kg/m2，收缩压(125±17)mmHg，舒张压(78±9)mmHg，三酰甘油(1.23±0.36)mmol/L。两组间无显著差异。

二、IAPP在胰腺组织中的表达

免疫组化染色显示，胰腺癌及其癌旁正常胰腺组织中的胰岛细胞胞质内可见棕黄色阳性颗粒，而非胰岛细胞区域未见明显阳性深染区，不合并糖尿病的癌旁胰腺组织中的胰岛的染色程度明显弱于其他3组(图1)。合并糖尿病的胰腺癌组织、癌旁胰腺组织、不合并糖尿病的胰腺癌组织及癌旁胰腺组织的免疫组化阳性指数分别为283 305±91 627、122 874±86 917、154 032±81 097和105 797±67 593。不管是否合并糖尿病，胰腺癌组织的免疫组化指数均显著高于相应癌旁正常胰腺组织(Plt;0.01)；合并糖尿病的胰腺癌组织的免疫组化指数显著大于不合并糖尿病的胰腺癌组织；而癌旁胰腺组织间的免疫组化指数无显著差异。

Western blotting检测与免疫组化结果一致(图2)。合并糖尿病的胰腺癌组织及其癌旁胰腺组织、不合并糖尿病的胰腺癌组织及其癌旁胰腺组织的IAPP相对表达量分别为(173.1±23.5)%、(119.4±18.4)%、(148.7±28.3)%和100%，不管是否合并糖尿病，胰腺癌组织的IAPP相对表达量均显著高于相应癌旁正常胰腺组织(Plt;0.01)；合并糖尿病的胰腺癌组织的IAPP相对表达量显著大于不合并糖尿病的胰腺癌组织(Plt;0.01)；合并糖尿病的癌旁胰腺组织的IAPP相对表达量显著大于不合并糖尿病的癌旁胰腺组织(Plt;0.05)。

图1合并糖尿病的胰腺癌组织(A)、合并糖尿病的癌旁胰腺组织(B)、不合并糖尿病的胰腺癌组织(C)及不合并糖尿病的癌旁胰腺组织(D)的IAPP表达(免疫组化 ×400)

图2合并糖尿病的胰腺癌组织(A)、合并糖尿病的癌旁胰腺组织(B)、不合并糖尿病的胰腺癌组织(C)及不合并糖尿病的癌旁胰腺组织(D)的IAPP表达(Western blotting)

讨 论

早在20世纪70年代就有研究显示，80%的胰腺癌患者确诊时已经发生了2型糖尿病或糖耐量异常[6],其后也有多项研究证实，胰腺癌与糖尿病及糖耐量异常密切相关[7]。1995年发表的纳入20个临床研究的荟萃分析显示，病程在5年以上的糖尿病患者中，胰腺癌的发病危险高于正常人群的2倍[8]，近年来发表的纳入50多个临床研究的多个荟萃分析也得出了相同的结论[9-10]。尽管多项流行病学资料显示糖尿病和胰腺癌有密切的相关性，但是使二者密切相关的因素及机制目前还不十分清楚。

以IAPP为主要成分的胰岛淀粉样蛋白沉积是2型糖尿病的一个典型病理特征。动物实验发现,猴和猫的自发性糖尿病模型胰腺体内都能形成胰岛淀粉样蛋白沉积,这些动物模型具有与人类2型糖尿病相似的症状,如发病年龄相对较大,伴有肥胖,由糖耐量异常发展为高血糖状态,最终依赖胰岛素治疗。Wang 等[11]通过对高表达hIAPP的转基因小鼠研究发现,当80%的β细胞不同程度受累时,约1.5%的β细胞被淀粉样沉积物代替,而当所有的细胞均受累时,约有10%的细胞被沉积物取代,此时,转基因小鼠表现出轻度胰岛素分泌功能受损,空腹血糖仍在正常范围。随着更多的β细胞被淀粉样沉积物取代,小鼠的血糖逐渐升高直至必须依赖胰岛素治疗。表明胰岛淀粉样蛋白沉积破坏了胰岛β细胞,造成β细胞功能受损，发生糖耐量异常进而导致糖尿病,因此,动物的胰岛淀粉样沉积可视为糖耐量异常和糖尿病的原因。

人类胰岛淀粉样蛋白沉积与糖耐量的关系比动物复杂得多,由于胰岛淀粉样蛋白沉积必须通过病理检查才能证实,这在人类很难做到。现有的尸体解剖虽然发现76%～90%的2 型糖尿病患者存在胰岛淀粉样蛋白沉积,而非糖尿病者只有0～50%发生胰岛淀粉样蛋白沉积[12-15],但是2 型糖尿病患者胰岛淀粉样蛋白沉积的轻重程度有很大差异,受累的胰岛β细胞范围为lt;1%～gt;80%,单个β细胞淀粉样变的严重程度差别也非常大。

许多研究表明，IAPP与胰腺癌及糖尿病的发病密切相关。Ding等[16]将β细胞暴露于胰腺癌细胞条件培养液中可以选择性地刺激β细胞分泌IAPP。Permert 等[5]研究发现胰腺癌合并糖尿病的患者血浆IAPP浓度明显高于非肿瘤人群及血糖正常人群，而胰腺癌组织中IAPP的表达水平低于癌旁胰腺组织以及正常胰腺组织，癌旁胰腺组织的胰岛B细胞IAPP表达也明显减少，作者认为IAPP在B细胞内产生但并没有正常地储存，这可能是外周血IAPP浓度升高的原因。他们[17]又通过导管细胞专一致癌物BOP诱导叙利亚金仓鼠发生胰腺癌，诱导后12周的血浆胰高糖素水平明显升高，诱导27周后，血浆胰岛素水平及IAPP水平明显升高，而胰腺组织IAPP浓度却明显降低，只有对照组的44%，进一步证实上述观点。

Mäkimattila等[18]报道，血糖正常的胰腺癌患者的血浆IAPP水平明显升高，而合并糖尿病的胰腺癌患者IAPP水平降低，从而认为IAPP与胰岛素的比值增高可以作为一个预测血糖正常的患者发生胰腺癌的检测因子。Chari等[19]报道，胰腺癌患者血浆IAPP浓度明显高于非胰腺癌患者，而且合并糖尿病者血浆IAPP浓度增高更加明显。

本实验结果显示，胰腺癌组织及癌旁胰腺组织的胰岛细胞均有IAPP的表达，癌组织IAPP的表达强于癌旁胰腺组织；合并糖尿病者的表达强于不合并糖尿病者，与Permert等[5]的结论不一致。Katsumichi等[20]检测正常人胰腺、糖尿病胰腺组织、胰腺癌组织及癌旁胰腺组织IAPP的表达，结果在胰腺癌组织的胰岛细胞中并未发现胰岛淀粉样变，而糖尿病患者的胰岛内均存在不同程度的淀粉样变，结果也不一致。分析原因可能与种族差异有关，但需要进一步证实。

[1] Westermark P.Amyloid and polypeptide hormones:What is their relationship? Amyloid:The International Journal of Experimental and Clinical Investigation,1994,Ⅰ:47-60.

[2] Zhao HL,Lai FM,Tong PC,et al. Prevalence and clinicopathological characteristics of islet amyloid in chinese patients with type 2 diabetes.Diabetes,2003,52:2759-2766.

[3] O′Brien TD.Pathogenesis of feline diabetes mellitus.Mol Cell Endocrinol,2002,197:213-219.

[4] Rand J.Current understanding of feline diabetes.Part 1.Pathogenesis.J Feline Med Surg,1999,1:143-153.

[5] Permert J,Larsson J,Westermark GT,et al.Islet amyloid polypeptide in patients with pancreatic cancer and diabetes.N Eng J Med,1994,330:313-318.

[6] Schwarts SS,Zeidler A,Moossa AR,et al.A prospective study of glucose tolerance,insulin,C-peptide,and glucagon responses in patients with pancreatic carcinoma.Am J Dig Dis,1978,23:1107-1114.

[7] Permert J,Ihse I,Jorfeldt L,et al.Pancreatic cancer is associated with impaired glucose metabolism.Eur J Surg,1993,159:101-107.

[8] Everhart J,Wright D.Diabetes mellitus as a risk factor for pancreatic cancer.a meta-analysis.JAMA,1995,273:1605-1609.

[9] Huxley R,Ansary-Moghaddam A,Berrington de Gonzalez A,et al.Type-II diabetes and pancreatic cancer:a meta-analysis of 36 studies.Br J Cancer,2005,92:2076-2083.

[10] Coughlin SS,Calle EE,Teras LR,et al.Diabetes mellitus as a predictor of cancer mortality in a large cohort of US adults.Am J Epidemiol,2004,159:1160-1167.

[11] Wang F,Hull RL,Vidal J,et al.Islet amyloid develops diffusely throughout the pancreas before becoming severe and replacing endocrinecells.Diabetes,2001,50:2514-2520.

[12] Westermark P,Wilander E,Westermark GT,et al.Islet amyloid polypeptide-like immunoreactivity in the islet B cells of type 2(noninsulin-dependent) diabetic and non-diabetic individuals.Diabetologia,1987,30:887-892.

[13] Westermark GT,Christmanson L,Terenghi G,et al.Islet amyloid polypeptide:demonstration of mRNA in human pancreatic islets by in situ hybridization in islets with and without amyloid deposits.Diabetologia,1993,36:323-328.

[14] Clark A,Cooper GJ,Lewis CE,et al.Islet amyloid formed from diabetes-associated peptide may be pathogenic in type 2-diabetes.Lancet,1987,2:231-234.

[15] Ohsawa H,Kanatsuka A,Mizuno Y,et al.Islet amyloid polypeptide-derived amyloid eposition increases along with the duration of type 2 diabetes mellitus.Diabetes Res Clin Pract,1992,15:17-21.

[16] Ding X,Flatt PR,Permert J,et al.Pancreatic cancer cells selectively stimulate islet beta cells to secrete amylin.Gastroenterology,1998,114:130-138.

[17] Permert J,Herrington KM,Kazakoff PM,et al.Early changes in islet hormone secretion in the hamster pancreatic cancer model. Teratog Carcinog Mutagen,2001,21:59-67.

[18] Mäkimattila S,Hietaniemi K,Kiviluoto T,et al.In vivo glucose-stimulated amylin secretion is increased in nondiabetic patients with pancreatic cancer.Metabolism,2001,50:1036-1042.

[19] Chari ST,Klee GG,Miller LJ,et al.Islet amyloid polypeptide is not a satisfactory marker for detecting pancreatic cancer.Gastroenterology,2001,121:640-645.

[20] Katsumichi I,Pour PM.Diabetes mellitus in pancreatic cancer:is it a causal relationship?Am J Surg,2007,194(4 Suppl):S71-S75.

2008-08-11)

(本文编辑：屠振兴)

Expressionofisletamyloidpolypeptideinpancreasofpatientswithdiabetrsandpancreaticcancer

CUINan,ZHOUDa-jin.

DepartmentofEndocrine,ChanghaiHospital,SecondMillitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

ObjectiveTo detect the expression of islet amyloid polypeptide (IAPP) in the pancreatic tissues of patients with pancreatic cancer, and to explore the relation between diabetes and pancreatic cancer.MethodsSurgically-removed 28 pancreatic cancer samples and adjacent normal pancreatic tissues were studied. Among these patients there were 12 patients complicated with diabetes while other 16 patients did not. Immunohistochemical method and Western blot method were used to detect the expression of IAPP in different tissue specimens.ResultsIAPP expressed in human pancreatic islet cell cytoplasm. Immunohistochemical index of pancreatic cancer and adjacent normal pancreatic specimens of patients with diabetes, and pancreatic cancer and adjacent normal pancreatic specimens of patients without diabetes were 283 305±91 627, 122 874±86 917, 154 032±81 097 and 105 797±67 593, respectively; the relative IAPP expressions were (173.1±23.5)%, (119.4±18.4)%, (148.7±28.3)% and 100%. Irrespective of the presence of diabetes, expression of IAPP in pancreatic cancer specimens was significantly higher than that in adjacent normal pancreatic specimens (Plt;0.01); expression of IAPP in pancreatic cancer plus diabetes specimens was significantly higher than that in pancreatic cancer specimens without diabetes (Plt;0.01); expression of IAPP in adjacent pancreatic specimens complicated with diabetes was significantly higher than that in adjacent pancreatic specimens without diabetes (Plt;0.05).ConclusionsIAPP participated in the course of diabetes and pancreatic cancer, and may be the common pathogenesis of the two diseases.

Pancreatic neoplasms; Diabetes mellitus, type 2; Islet amyloid polypeptide; Immunohistochemistry; Boltting, western

Correspondintauthor:ZHOUDa-jin,Email:zwdj22@medmail.com.cn

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2009.02.015

200433 上海，第二军医大学长海医院内分泌科

邹大进，Email: zwdj22@medmail.com.cn