CYP2C19基因多态性与首发缺血性卒中氯吡格雷二级预防复发风险的关联研究

曾涛，肖旋浩，徐邦牢，雷秀霞，李泽，周进，黄翚，潘小平

氯吡格雷是缺血性卒中二级预防的推荐抗血小板用药。作为一种前体药物，氯吡格雷必须经过肝细胞色素P450酶（cytochrome P450，CYP450）才能代谢成为活性产物，发挥抗血小板聚集的作用，其中CYP2C19发挥着最为重要的作用。研究证明，CYP2C19基因多态性与氯吡格雷的血小板抑制程度密切相关，快代谢（extensive metabolizer，EM）型人群的血小板抑制率要高于中代谢（intermediate metabolizer，IM）型和慢代谢（poor metabolizer，PM）型人群[1]。本课题组前期研究发现，我国不同地区和不同种族间CYP2C19基因多态性的分布有差异，广州地区老年汉族人群以中快代谢型为主，可能影响氯吡格雷的疗效，从而引起卒中复发[1-2]。本研究拟在汉族首次缺血性卒中患者中，探讨规律服用氯吡格雷进行缺血性卒中二级预防卒中复发风险与CYP2C19基因多态性的关系。

1 研究对象与方法

1.1 研究对象 连续入组2013年8月-2015年8月于广州市第一人民医院神经科住院治疗的急性缺血性卒中患者。纳入标准：①发病1周内，经头颅计算机断层扫描（computed tomography，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）证实有新发病灶，符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2010》中缺血性卒中诊断标准[3]；②首次发病，既往无缺血性卒中病史；③汉族患者；④急性卒中治疗低分子肝素试验（Trial of Org 10 172 in Acute Stroke Treatment，TOAST）分型为大动脉粥样硬化性脑梗死或小动脉闭塞性脑梗死类型，经临床判断适合应用氯吡格雷治疗进行二级预防的患者[4]。排除标准：①有凝血功能障碍者或其他有血液疾病的患者；②有严重心、肝、肾脏疾病者；③既往卒中病史。该研究经过广州市第一人民医院伦理委员会批准，研究对象均签署知情同意书。

2.2 基线数据 收集入组患者的年龄、性别、TOAST分型、既往病史、吸烟（连续或累积吸烟半年以上，每日超过1支）、酗酒（每周酒精摄入超过300 mg）、此次入院后生化检查、颈动脉狭窄和颅内动脉狭窄情况。

既往病史包括：高血压、糖尿病、冠状动脉粥样硬化性心脏病、高脂血症、高同型半胱氨酸（high-homocysteine，Hcy）血症等；入院后生化检查包括：胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、甘油三酯、Hcy等。颈动脉狭窄根据颈动脉超声检查判断，以狭窄率50%以上为存在狭窄；颅内动脉狭窄根据头颅磁共振血管成像（magnetic resonance angiography，MRA）检查判断，以狭窄率50%以上为存在狭窄。

1.2 终点事件和随访方法 终点事件：出现缺血性卒中复发。随访方法：通过门诊、电话随访等方式在患者出院后每3个月进行1次随访，记录患者服药情况、终点事件的发生以及发生时间。中途改用其他抗血小板药物或停服氯吡格雷的患者被排除。对具体患者发生终点事件即停止随访，研究随访最终截止时间为2016年10月。

1.3CYP2C19基因检测方法 所有研究对象均于清晨空腹采集前臂静脉全血，置于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管内，混合均匀后吸取200 μL，根据全血DNA提取试剂盒内说明书提取全血基因组DNA。通过CYP2C19基因检测试剂盒（BaiO）检测基因分型。具体如下：①聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）反应体系：19 μL反应扩增液、1 μL反应液[包含脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）酶等]和5 μL DNA模板，低速离心混匀。636、681位点的扩增分别在两个独立的反应管中进行。②反应条件：50 ℃ 5 min，94 ℃预变性5 min，35个循环（94 ℃ 25 s，48 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s），72 ℃延伸5 min。③杂交：按照产品说明书，依次加入预杂交液、杂交反应液、洗脱液、抗体液、显色液。④结果判读：将玻璃芯片板和杂交产物放入芯片识读仪。利用ArrayDoctor软件自动扫描、分析杂交结果。CYP2C19*1为第636位和第681位均未发生突变的野生型。CYP2C19*2为第5号外显子681位碱基G突变为A；CYP2C19*3则为第4号外显子第636位碱基处G突变成A，这两个突变都致使蛋白的合成提前终止，造成酶活性缺失。这两个突变形成杂合或纯合突变，从而呈现6种基因型。其中*1/*1（636GG，681GG）为快代谢型；*1/*2（636GG，681GA）、*1/*3（636GA，681GG）为中代谢型；*2/*2（636GG，681AA）、*2/*3（636GA，681GA）、*3/*3（636AA，681GG）为慢代谢型。

1.4 统计学处理 用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析。以Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验样本的群体代表性。计量资料符合正态分布，用表示，计数资料采用率表示。χ2检验或者Fisher确切概率法比较不同代谢型、基因型及等位基因组缺血性卒中复发率的差异，P＜0.05认为差异有统计学意义。应用单变量Logistic回归分析对缺血性卒中危险因素及CYP2C19功能缺失（loss of function，LOF）携带情况与缺血性卒中复发情况进行分析，将P＜0.10的变量进行多因素Logistic回归分析，计算比值比（odds ratio，OR）和95%可信区间（confidence interval，CI）。

2 结果

2.1 患者的临床特点及CYP2C19基因型分布研究期间共有326例患者符合纳入、排除标准，326例中失访有10例，失访率为3.1%，随访时间范围为1～37个月，平均（14.44±5.07）个月。失访患者与纳入患者的基线数据没有差异。其中139例规律服用氯吡格雷进行卒中二级预防的患者，男性96例，女性43例，年龄55～89岁，平均（69.43±11.95）岁，携带者（携带有CYP2C19*2及*3基因型的患者）有78例，非携带者有61例，携带者与非携带者间的基线数据无差异（表1）。检出快代谢型（CYP2C19*1/*1）61例，中代谢型（CYP2C19*l/*2或*1/*3）64例，慢代谢型（CYP2C19*2/*2或*2/*3或*3/*3）14例，Handy-Weinberg平衡检验P=0.82（表2）。

2.2CYP2C19基因代谢型及等位基因频率与卒中复发的关系 慢代谢型在卒中复发组有7例、非复发组有7例，频率分别为24.14%和6.36%，以快代谢型为对照，OR值为9.17，P＜0.001。中代谢型在卒中复发组有16例、非复发组有48例，频率分别为55.17%和43.64%，以中代谢型为对照，OR值为3.05，P=0.025（表3）。

携带*2（G681A）A等位基因者在卒中复发组及无复发组的频率分别是为44.83%及23.64%，与G等位基因相比相对风险值OR为2.625，P＜0.001。携带*2突变杂合子（CYP2C19*1/*2、*2/*3）的患者卒中复发风险是野生型的2.82倍，P=0.026。而携带*2突变的纯合子（CYP2C19*2/*2）的患者卒中复发风险是野生型者9.69倍，P＜0.001。携带*3（G636A）A等位基因者与野生型G等位基因比较，卒中复发风险的差异无统计学意义（表4）。

2.3 卒中危险因素及CYP2C19失功能等位基因数与卒中复发风险的关系 单变量逻辑回归分析对缺血性卒中危险因素及CYP2C19LOF等位基因携带数与卒中复发情况进行分析，发现LOF等位基因携带数与卒中复发存在相关（表5）。多因素二元逻辑回归分析发现LOF等位基因携带数与卒中复发相关，携带有1个失功能等位基因者卒中复发的风险是未携带者的3.02倍，95%CI1.13～8.05，P=0.030，携带2个LOF等位基因者卒中复发的风险是未携带者的11.01倍，95%CI2.67～45.24，P＜0.001。

表1 研究对象的基线数据

表2 CYP2C19基因型Hardy-Weinberg平衡检验

表3 CYP2C19基因代谢型与卒中复发风险的关系

3 讨论

本研究共纳入了139例规律服用氯吡格雷进行卒中二级预防的首发缺血性卒中患者，发现携带CYP2C19LOF等位基因的患者缺血性卒中复发的概率高于非携带者，且具有基因剂量效应，表现为携带2个LOF等位基因的患者卒中复发的发生率最高。多因素的二元逻辑回归分析显示，携带CYP2C19LOF等位基因是首次缺血性卒中患者氯吡格雷治疗后卒中复发的独立危险因素。携带1个LOF和携带2个LOF等位基因卒中复发分别是非携带者的3.02倍和10.99倍。

表4 CYP2C19基因型及等位基因频率与卒中复发风险的关系

表5 卒中危险因素的单因素回归分析

目前国内外研究均证实，CYP2C19基因突变与氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance，CR）关系密切，但大多数研究集中于冠状动脉粥样硬化性心脏病的研究中，CYP2C19基因多态性与卒中相关性的研究相对较少，且结论不一[5]。在一项纳入625例急性缺血性卒中患者服用氯吡格雷进行卒中二级预防的研究中，经过为期3个月的随访后发现，携带有CYP2C19*2/*3变异的LOF等位基因的患者较非携带者出现复合血管事件（包括血管性死亡、非致命性缺血性卒中、非致命性心肌梗死）的风险升高[6]。Ling Fang等[7]的研究也得出了类似的结果，携带有2个CYP2C19LOF等位基因的急性卒中患者出现卒中复发的概率是非携带者的4.17倍（95%CI1.18～18.80，P＜0.05）。最近王拥军团队[8]关于CYP2C19LOF等位基因和氯吡格雷降低小卒中或短暂性脑缺血发作（transient ischemic attack，TIA）患者风险关系的研究中发现，使用氯吡格雷联合阿司匹林抗血小板治疗仅能减少非携带者新发卒中的风险。以上研究结果表明，CYP2C19基因型在预防卒中复发中扮演着重要角色，携带CYP2C19LOF等位基因是卒中复发的危险因素，与本研究的结果一致。

同时，有的研究并未得到阳性的结果。在Jia Dong M等[9]的研究中发现，以血小板聚集功能为标准的实验室检测发现，CYP2C19基因型与CR相关，是缺血性卒中患者CR的一个独立的预测因子，且以改良Rankin量表（modified Rankin scale，mRS）评分评估的预后分析发现，CYP2C19*2、*3等位基因携带者较非携带者的临床转归差。但对于卒中复发统计分析，未发现卒中复发与CYP2C19相关，这可能与该研究的卒中复发率低有关（2.32%）。同样的，在Li Na Qiu等[10]的研究中也发现CYP2C19基因与氯吡格雷的反应密切相关，但CYP2C19基因型与卒中复发相关性的研究中，同样未得出阳性结果。这说明，即使通过血小板功能检测发现存在有氯吡格雷生化抵抗，并不能等同于发生临床抵抗，这除了与影响卒中发生的因素众多有关外，也与血小板激活对卒中的病理生理过程的影响并不如冠状动脉粥样硬化性心脏病大有关[11]。而这也是本研究的纳入对象为首发缺血性卒中患者的原因，以尽可能减少潜在的干扰因素。

在本研究中，携带有CYP2C19LOF等位基因的患者占56.12%，与既往的报道相似，远高于白色人种和黑色人种[12]。我国是卒中大国，每年有大约300万新发卒中患者，而根据中国卒中登记调查的数据显示，缺血性卒中患者在发病后6个月内的复发率高达16%。因此，研究CYP2C19基因多态性与卒中复发之间的关系，对于降低卒中复发风险意义重大。根据本研究结果，完善卒中患者的CYP2C19基因多态性筛查对于指导临床个体化的抗血小板治疗是有意义的。而根据CYP2C19的基因型，调整抗血小板药物治疗，如加大药物剂量、联合用药或者使用新型的抗血小板药物（替格瑞洛、普拉格雷等）可能是潜在的解决CR的方法，但尚未得到充分的评估[13]。而根据血小板功能检测结果调整抗血小板药物剂量，对于改善患者预后似乎也无益处。最近法国35家中心参与，开放标签、盲法终点的正常剂量和个体化剂量普拉格雷降低老年（＞75岁）患者支架治疗后出血、支架血栓形成和缺血并发症（Assessment of a Normal Versus Tailored Dose of Prasugrel After Stenting in Patients Aged ＞75 Years to Reduce the Composite of Bleeding，Stent Thrombosis and Ischemic Complications，ANTARCTIC）研究结果显示，根据血小板功能监测调整抗血小板药物剂量不能改善急性冠状动脉综合征需要冠状动脉支架手术老年患者的临床预后[14]。目前尚未有针对卒中患者的相关研究。

本研究存在以下不足，一是本研究的对象主要为广州本地汉族人群，且仅检测了CYP2C19基因最为常见的CYP2C19*1/*2/*3等位基因。二是样本量相对较小。根据目前的研究结果，携带有CYP2C19LOF等位基因是缺血性卒中患者氯吡格雷治疗后卒中复发的独立危险因素，但对于携带有CYP2C19LOF等位基因的缺血性卒中患者抗血小板治疗方案调整，尚需更多的研究。

【点睛】本研究显示，在校正其他因素后，携带CYP2C19失功能等位基因是规律服用氯吡格雷的首次缺血性卒中患者缺血性卒中复发的危险因素。