卒中动物模型的研究进展

尹春雨，朱东亚

卒中是影响全球人类健康的重大疾病之一，它具有较高的发病率、致残率和死亡率。卒中的发病机制相当复杂，按其机制的不同可以分为缺血性和出血性，针对卒中，目前尚缺乏有效的预防和治疗手段。显然，建立并完善与临床相关性高的卒中动物模型以及对其深入研究，是揭示卒中病理机制的有效途径，这对卒中新药研发有着十分重要的意义。本文将对传统的和改良的缺血性和出血性卒中动物模型的制备方法及其优缺点进行归纳，并对未来卒中动物模型的探究提出相应的展望。

1 脑缺血动物模型

1.1 常用的脑缺血动物模型

1.1.1 线栓法 大脑中动脉闭塞是人类缺血性卒中发生最常见的原因。线栓法局灶性脑缺血模型由于其病理机制与临床上卒中患者的脑缺血情况类似，因此是目前国内外常用的脑缺血动物模型。1986年Koizumi等[1]首次提出运用非开颅手术的方法阻塞大脑中动脉形成脑缺血模型，而1989年Longa等[2]对此模型进行了改良。其实验方法是先分离并结扎颈外动脉，同时暂时性结扎颈总动脉。将颈内动脉进行分离，剪断颈外动脉，从颈外动脉靠结扎线的远端做一切口，插入尼龙线使其经过颈总动脉分叉进入颈内动脉至有轻微阻力为止，阻断邻近的大脑中动脉的所有血供。其优点在于该模型避免了开颅手术，可任意地控制再灌的时间以及是否永久性等，便于实验的探究。其缺点是：重现性差；要求操作人有专业的手术技能以确保精准地插栓，减少因操作带来的对其他部位的损伤[3]；会导致蛛网膜下腔出血，从而引起较高的死亡率[4]。

1.1.2 光栓法 1985年Watson等[5]引进光栓法在大鼠脑皮质上产生局灶性脑梗死。该方法的主要原理是用全身给药的方式腹腔注入玫瑰红染料然后对大鼠的头颅局部位置进行光照从而激活光化学反应，光照激活玫瑰红染料形成自由激进分子形式，导致破坏内皮细胞的功能以及在脑皮质的血管中形成局部血栓。光栓法不是阻塞某一动脉，而是引起大脑皮层中某一特定区域中的微血管阻塞[6]，其形成的脑梗死会产生长期的感觉运动障碍，因此该方法可用于探究慢性卒中的长期功能恢复[7]。优点：该方法实验过程简单，无创性；具有较高的重现性和较低的死亡率；可应用在线粒体功能紊乱、炎症反应、神经退行性疾病等相关方面的研究。缺点：在损伤内皮细胞的同时会破坏血脑屏障以及产生血管性水肿[8]，会产生较小的缺血半暗带，与人类脑缺血的病理机制不太相符。

1.1.3 栓塞法 栓塞法脑缺血模型在1982年初次应用在大鼠上，Kudo等[9]将较小的凝块注入颈总动脉或颈内动脉中，替代了线栓法。目前常用的方法是将含有栓塞剂（微球体、自体或异体血凝血块）的导管植入大脑中动脉中，利用激光多普勒血流计确定栓塞位置，打入栓子后撤回导管。该方法具有临床相关性，适用于血栓溶解方面的研究，当给予正确位置的栓子时会引起较大的损伤，包括皮层以及皮质下的区域，同时可引起较为显著的行为学缺陷。缺点：会出现脑出血的情况；具有较高的死亡率；引起多灶性缺血，甚至在对侧区域也会有相应的损伤[10]。

1.1.4 血栓栓塞法 血栓栓塞模型十分接近临床卒中患者脑缺血的病理情况，该模型适用于临床前对溶栓剂的评价。多数情况下，采用自体取血的方法形成血栓将其注入大脑中动脉或颈内动脉中[11]。该方法的不足之处在于：重现性差，不能保证脑损伤区域的位置和大小[12]；制备血栓易受多因素的影响；不适用于缺血再灌注的研究。

1.2 改良型脑缺血动物模型

1.2.1 微球注入法 微球模型是一种血管内的栓塞型卒中模型，类似于心源性和动脉-动脉的栓塞[12]。将大鼠麻醉后，分离出右侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，用5-0缝线结扎甲状腺上动脉、枕动脉和翼腭动脉，用3-0缝线结扎颈外动脉末端同时暂时性结扎颈总动脉和颈内动脉，在颈外动脉上剪口，插入含有6个TiO2微球体（直径：0.3～0.4 mm）的导管缓慢注入颈内动脉中，在血流的帮助下使微球体被冲到大脑中动脉的位置，注入完成后用肝素钠稍冲洗颈内动脉，撤回导管，进行缝合。运用该方法产生的局灶性脑梗死，包括皮质和皮质下区域，避免了对下丘脑产生损伤。通过该方法对脑血流量的时间与空间的动力学、能量代谢、神经炎症、干细胞再生等方面进行临床前研究。遗憾的是，此方法不能用于缺血再灌注方面的研究[13]。

1.2.2 改良大鼠血栓法 Zhang等[14]在大鼠上对血栓栓塞模型进行了改造。首先是自体血血栓的制备：取Wistar大鼠股动脉的血流入PE-50管子中使其在37℃条件下孵育2 h，再转入4℃条件下孵育22 h形成血栓，造模前用0.9%生理盐水清洗血栓10～15次。其次将大鼠麻醉后，暴露一侧颈总动脉，分离颈内动脉与颈外动脉（避免触碰迷走神经），结扎并剪断颈外动脉远端的一侧，用动脉夹暂时性夹闭颈总动脉和颈内动脉，从颈外动脉靠结扎线的远端做一切口，插入含有血栓的PE-50管子使其进入颈内动脉，插至有阻力的位置，打开动脉夹，撤回管子1～2 mm，使用微量注射器以10 μl/min的速度缓慢注入血栓，注入完成后停留5 min，确保血栓到达颈外动脉/颈内动脉的交叉点，再次用动脉夹暂时性夹闭颈总动脉和颈内动脉，撤回PE-50管子，结扎颈外动脉上的切口，缝合伤口。改良后的大鼠血栓法形成脑缺血可模拟人类缺血性卒中的实际情况，该方法适用于研究溶栓和溶栓与神经保护剂联合用药。但是其产生的梗死灶的位置和大小变异性大，容易发生再灌注的现象。

1.2.3 改良小鼠血栓法 Chen等[15]将小鼠气体麻醉后，在显微镜下分离暴露小鼠右侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉，结扎并剪断颈外动脉，同时暂时性结扎颈总动脉和颈内动脉，在颈外动脉上剪口，将含有2 NIHU α-凝血酶的PE-8导管插入切口中将其缓慢注入颈外动脉中，注入完成后从颈外动脉中吸取3 μl血流入导管中，然后在空气中暴露15 min形成血栓。其次暂时性结扎颈总动脉和颈内动脉，将含有血栓的导管再次顺着颈外动脉的切口进入到颈内动脉中，使导管的尖端位于距大脑中动脉1～2 mm处，缓慢注入血栓10 min后，撤回导管，结扎颈外动脉，释放颈总动脉。全过程在激光多普勒血流仪的监测下进行，可观察到血栓的位置以及形成情况。该方法所需时间较短，仅在单次麻醉下，采用自体取血的方法，精确定位血栓的位置，产生重现性较好的局部脑梗死，具有较低的死亡率，同时避免了开颅手术和硬脑膜的渗透。为缺血性脑损伤的研究提供了新的思路与方法。

1.3 其他

1.3.1 猴脑缺血模型 Zhang等[16]将受试猴全身麻醉后，暴露颅骨，从左外侧前额叶皮层处打开硬脑膜，在大脑中动脉的左侧M1部位，距嗅束2 mm处，用5 mm钛合金动脉夹短暂性夹闭4 h后，移去动脉夹形成血流再灌。用激光多普勒血流计监测前额叶皮层中的相对脑血流量（relative cerebral blood flow，rCBF）的变化。

1.3.2 狒狒脑缺血模型 Huang等[17]将狒狒通过左侧经眶颅骨切除术暂时性夹闭身体同侧的颈内动脉、脉络丛前动脉以及双侧大脑前动脉A1近端的前交通动脉，夹闭1 h。这种方法不仅可以引起皮质以及皮质下灰质的损伤，还可以引起皮质下白质的受损。同时，可减少侧支循环的可变性，产生较为稳定的梗死区域[18]。

1.3.3 犬脑缺血模型 为了更好地模拟临床卒中患者发病情况，实现向临床的转化，Christoforidis等[19]在犬的椎动脉中置入导引导管，将含有栓塞线圈的微导管插入到该导管内，在荧光显微镜下使其经脊分支动脉、基底动脉、后交通动脉到达大脑中动脉，将微导管内的栓塞线圈注入大脑中动脉中，通过血管造影仪观察线圈的位置是否正确，阻塞60 min，结果导致部分闭塞大脑中动脉M1段、颈内动脉的远端和大脑前动脉的始端位置，60 min后取出线圈撤回导管。该模型可准确定位栓塞位置，当位置不准确时，可进行重新定位。

1.3.4 家兔脑缺血模型 目前，家兔微血栓栓塞性卒中模型用于急性脑梗死的相关研究，然而该模型存在许多限制性因素，English等[20]对其进行改造。该模型是在荧光显微镜下，利用血管造影技术将1.5 F微导管通过左侧椎动脉至基底动脉进而插入到右侧大脑后动脉中，使微导管的尖端位于右侧大脑后动脉的始端，持续不同的时间形成不同程度的大血管阻塞。将微导管撤回后形成血流再灌。该方法的优点在于可以精确定位栓塞的位置，产生时间依赖型的皮质及皮质下区域的损伤，重复性较强，可以准确控制阻塞和血管再生的时间，有利于进行可逆和不可逆的急性脑缺血的研究。

1.3.5 自发性脑缺血模型 将易卒中型自发性高血压大鼠用2.0%异氟烷麻醉后，在显微镜下，沿腹侧中线切开，暴露右侧颈总动脉并进行结扎。该方法可产生局灶性脑缺血，破坏血脑屏障以及点状出血，可引起血管周围炎症和认知功能障碍[21-22]。

2 脑出血动物模型

2.1 常用的脑出血动物模型

2.1.1 自体血注入法 该模型是将不同体积的自体血通过立体定位的方法注入动物的纹状体中形成脑血肿，会出现脑血肿以及周围脑区的CBF减少的现象，这种现象依赖于自体血的体积量，但不引起脑灌注压力的改变。通过注入自体血产生的脑出血并不会破坏脉管系统[23]。有文献报道，使用注入半凝结的自体全血的方法，6 min内注入60 μl会导致组织学上明显的变化以及神经系统的障碍[24]。优点：能够模拟出血性卒中患者的出血情况。缺点：重复性差；由于心室破裂以及血液顺着针孔的回流，因而无法预计血肿的程度和大小。就现阶段研究来看，自体血注入法模型是较为理想的有效脑出血模型，与临床上脑出血的情况十分类似，便于研究其病理生理变化及脑血流的改变情况，为脑出血的临床治疗提供有力的证据。

2.1.2 胶原酶注入法 胶原酶是蛋白水解酶，在细胞中以非活性形式存在。该模型的主要原理是利用胶原酶的酶促反应破坏血管的基膜引起血液向周围组织渗漏。该方法的优点在于重复性强，可形成较一致的出血体积。然而与自体血注入法不同的是注入胶原酶会破坏脉管系统，同时使脑血肿膨胀变大[25]，还会产生其他非出血性的反应，破坏其他类型的血管，如毛细血管[23]，与临床上脑出血情况有一定的差别。由于胶原酶自身可引起炎症反应，因此该方法不适用于研究脑出血后的炎症反应相关机制。

2.2 改良型脑出血动物模型

2.2.1 蛛网膜下腔出血动物模型 蛛网膜下腔出血会导致神经功能严重紊乱，出现如偏瘫、情感障碍、认知和记忆功能受损。Li等[26]将C57BL/6J小鼠腹腔注射戊巴比妥钠（80 mg/kg）进行麻醉后，首先将激光多普勒血流仪置于小鼠左侧颞骨处监测左侧半球的血流情况。其次分离小鼠左侧颈总动脉、颈内动脉和颈外动脉，在颈外动脉处剪开约3 mm小口，将6-0尼龙线从颈外动脉切口处插入颈内动脉至有阻力为止，约距颈总动脉分支点1.0 cm，稍刺破血管2 mm处。该方法是首次在小鼠上利用血管穿刺的方法形成蛛网膜下腔出血的动物模型。

2.2.2 向小脑延髓池注射血液致蛛网膜下腔出血动物模型 Guvenc Tuna等[27]将Wistar大鼠用2%异氟烷麻醉后，进行针穿刺寰枕关节膜，将0.2 ml动脉血注入小脑延髓池内，为了防止血液回流，注入完成留针数分钟后缓慢撤回。该模型的优点在于可根据注射的血液量及注射的次数调节蛛网膜下腔出血的严重程度，但其缺点在于属于非生理性血液分布。

2.2.3 自发性脑出血模型 该方法是将易卒中型自发性高血压大鼠用戊巴比妥（45 mg/kg，腹腔注射）麻醉后，在右侧股动脉插入导管进行取血100 μl，将大鼠脑固定在立体定位仪上，头部正中切开，暴露前囟点，使前囟点与后囟点在同一水平上（坐标：距前囟点前0.2 mm，旁开3.5 mm，深度5.5 mm），用脑立体定位钻进行钻孔，将针植入右侧基底神经节，使100 μl自体血缓慢注入右侧基底神经节中（速度：10 μl/min），注射完毕留针10 min后缓慢退针，用骨蜡封闭针眼，缝合皮肤。该模型取自体动脉血，导致的脑出血与临床上高血压脑出血患者的发病情况十分类似，然而在发生脑出血时，由于无法选择出血区域，不易控制出血量，死亡率较高[28]。

3 总结与展望

本文对于各种缺血性和出血性卒中动物模型的制作方法及其优缺点进行了分析阐述。各种模型具有各自的优缺点，可根据不同的实验目的选择相应的实验动物模型。卒中受多因素影响，其发病机制较为复杂，因此，选择重现性高、临床相关性高的动物模型研究卒中的发病机制，对卒中新药研发具有十分重要的临床意义。

当前，一味地针对动物模型的重现性进行的改良已经不能满足人们对于卒中病理机制探索的要求。如何对卒中动物模型进行改进使其与临床患者情况更加吻合，仍然是目前医学科研者需要解决的难题。同时，如何将在动物模型上的最适药物剂量转化到临床患者上，以及脑组织损伤后啮齿类动物与人类的不同免疫系统反应，也是一个巨大的挑战。因此明确模型动物和人类的种属差异，并选择合适的行为学检测方法对于研究受试药物的药理学效应及其临床转化也是十分重要的。所以，探索出更接近人类卒中发病过程的动物模型迫在眉睫，这可能会进一步加深人们对于卒中病理机制的认识，进而开发出利于转化的药物，为卒中的治疗开辟新的道路。

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