Minocycline对血管性抑郁小鼠抑郁行为及神经递质的作用

李海龙，刘敏，张海，郑惠文，周凯歌，王云霞，毕晓莹

血管性抑郁（vascular depression）是老年迟发性抑郁的一个主要类型，与脑血管疾病及其危险因素密切相关，常伴有以执行功能障碍为主的认知功能障碍，属难治性抑郁，且易发展为血管性痴呆（vascular dementia，VaD）。但血管性抑郁的发病机制至今不明。炎症假说认为，促炎性细胞因子可通过影响单胺类神经递质的代谢通路导致5-羟色胺的减少以及色氨酸毒性代谢产物的增加，进而促使海马神经元坏死和凋亡，导致了抑郁症状和认知功能障碍的发生[1]。本课题组前期的研究也发现在反复缺血再灌注法制备的血管性抑郁动物模型中，中枢炎症细胞——小胶质细胞活化增生，炎症相关核转录因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）p65/p50表达增加[2]，提示炎症与血管性抑郁可能存在一定的关系。

但是常规抗抑郁药物如5-羟色胺再摄取抑制剂（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）或5-羟色胺及去甲肾上腺素再摄取抑制剂（serotonin-norepinephrine reuptake inhibitor，SNRI）通过增加突触间隙5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）及去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）改善抑郁，但对血管性抑郁疗效欠佳。研究发现，过高的炎性细胞因子可影响脑内单胺类神经递质（如5-HT）的合成和再摄取，进而导致抑郁[3]，提示血管性抑郁中炎症反应所伴的炎性细胞因子表达增高可能也参与影响了相关神经递质的代谢及结构，从而导致常规抗抑郁药物疗效不佳，且容易出现认知损害。

因此，本研究拟在前期研究的基础上，通过外源性抗炎药物minocycline抑制多种促炎性细胞因子表达，观察血管性抑郁小鼠行为及神经递质代谢的变化，初步探讨炎症抑制在血管性抑郁治疗中的作用，为临床对血管性抑郁患者的治疗提供实验依据。

1 材料方法

1.1 实验动物分组及模型构建 CD1雄性小鼠30只，周龄10周，体重25～30 g（订购于第二军医大学实验动物中心，SPF级），随机分为实验组、对照组和假手术组，每组10只，造模前常规条件下饲养1周。

应用前期实验中采用的反复缺血再灌注法进行制备血管性抑郁小鼠模型[2-5]。步骤如下：小鼠经腹腔注射0.3%戊巴比妥麻醉成功后，取仰卧位，门齿及四肢固定，剪开颈前皮肤及筋膜，在气管两侧分别分离出左右颈动脉，使用小号动脉夹阻断双侧颈动脉供血5 min后，松开动脉夹恢复供血10 min，再次阻断供血5 min后移除动脉夹，术中密切观察小鼠呼吸、心跳，术毕缝合皮肤，立即腹腔注射minocycline（30 mg/kg），对照组给予腹腔注射等剂量生理盐水，恒温板上复苏，清醒后放回笼中常规饲养。假手术组除不阻断颈动脉供血外，其余手术操作与实验组相同。小鼠手术当日定为术后第1天，术后第1～7天依照不同分组连续注射minocycline及生理盐水每日一次，给药完成后于术后第8天开始行为学检测。前期工作已发表模型组与假手术组行为学检测的结果，在悬尾实验、暗箱实验等抑郁行为检测中发现，模型组动物较假手术组出现明显的抑郁行为，确定动物模型成功[4-5]。

1.2 行为学检测 抑郁行为学检测包括悬尾实验（tail suspension test，TST）、探洞旷场试验（open-field test）、认知功能检测为Morris水迷宫检测。造模术后第8天开始行为学测试。

TST检测动物的抑郁行为，基于Steru等[6]之前建立的方法稍加改进，采用美国MED association公司Med小鼠悬尾系统，安排在术后第8天18∶00～22∶00进行，距尾尖约1 cm处用胶布固定于悬尾系统测试箱的尾钩上，小鼠头部距地面约7.5 cm，关闭测试箱开始计时，共观察6 min，适应2 min，设定软件记录后4 min的小鼠不动时间。与假手术组的小鼠不动时间相比较，当实验组或对照组小鼠不动时间显著延长，可判定为小鼠出现抑郁行为。

探洞旷场试验检测动物的抑郁行为，根据文献中介绍的通用的小鼠分析方法[7]。采用上海吉量软件科技公司的DigBehv动物行为视频跟踪分析系统于术后第9天进行，将小鼠依次放入旷场测试箱（25 cm×25 cm×38 cm）中，测试箱底部有16个圆形小洞，放入小鼠后2 min开始记录，测试时间15 min，记录探洞次数、活动时间与总路程。当实验组或对照组小鼠较假手术组小鼠探洞次数减少、活动时间缩短或总路程减少且差异有显著性时，可判定为该组小鼠出现抑郁行为。

Morris水迷宫检测动物的认知行为，按照文献中[8]对小鼠空间认知检测的方法进行定位航行实验。实验采用上海吉量软件科技公司的DigBehv动物行为视频跟踪分析系统水迷宫装置，水池直径120 cm，高50 cm，维持水温21～22℃，第三象限放置平台，平台置于水面下1 cm，术后第10天开始测试（第9天进行训练，每只小鼠训练4次，每次120 s），随机选择4个象限作为入水点，将动物面向池壁放入水中，同时开始记录小鼠入池至寻找并爬上平台所需时间，即潜伏期（latency），使其在平台上停留20 s后取走，如小鼠在120 s内未找到平台则将其引导上台并停留20 s，记录潜伏期为120 s，计算每只小鼠的平均潜伏期。

1.3 海马组织肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6含量测定 小鼠术后第11天处死，磷酸钠盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）灌注，剥离脑组织，冰上操作分离海马，称重后加入150 μl生理盐水匀浆，采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测盒（上海酶联生物科技公司提供），根据操作说明进行测定肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）含量，检测范围最低值分别为1.4 pg/mg、9.1 pg/mg及0.2 pg/mg。

1.4 5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺含量测定方法与标准曲线 采用美国安捷伦公司高效液相色谱仪Agilent 1100 Series HPLC，包括在线脱气机、四元泵、高性能自动进样器、柱温箱、荧光检测器，色谱柱采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6×150 mm 5 μm）；流动相：0.1 mol NaAc+0.01 mol乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）（醋酸调节pH=5.1）：甲醇（V/V）=93∶7；柱温：30℃；流速：1.0 ml/min；进样量：20 μl；荧光增益值：10；激发波长：290 nm；发射波长：330 nm。精密称取3种神经递质标准品至10 ml量瓶中，用2%的HClO4生理盐水溶解制得标准溶液。对3种标准溶液依次稀释，制得浓度为2.0 μg/ml、1.0 μg/ml、0.4 μg/ml、0.2 μg/ml、0.1 μg/ml和0.04 μg/ml的标准系列溶液，取标准系列溶液20 μl进样分析，以各成分的浓度（C，μ g/ml）对3种待测物峰面积（Y），用最小二乘法进行线性回归分析，得标准曲线方程及相关系数（表1）。

表1 去甲肾上腺素、多巴胺、5-羟色胺标准曲线

1.5 海马组织中5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺的含量测定 精密称取小鼠海马组织于1.5 ml的EP管中，加入150 μl生理盐水匀浆，加入100 μl的4%HClO4溶液，于14 000 rpm下低温离心 20 min，取上清液进样分析。

1.6 统计学方法 采用SPSS 19.0软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以（s）表示，各组间比较采用单因素方差分析，两组之间的比较采用SNK检验，P＜0.05被认为差异有显著性。

2 结果

2.1 minocycline对血管性抑郁小鼠抑郁行为及认知能力的影响 悬尾实验中，实验组、对照组及假手术组的小鼠悬尾不动时间差异具有显著性（F=6.59，P=0.005）（表2），SNK检验显示，与对照组相比，实验组和假手术组悬尾不动时间缩短，差异有显著性，实验组小鼠悬尾不动时间长于假手术组，但两组差异无显著性；探洞旷场实验中，实验组、对照组及假手术组的小鼠探洞次数、活动时间、活动路程差异具有显著性（F=6.17，P=0.008；F=11.55，P＜0.001；F=13.47，P＜0.001）（表2），SNK检验显示，与对照组相比，实验组和假手术组探洞次数、活动时间、活动路程均增多，且差异有显著性，实验组较假手术组的探洞次数增多、活动时间减少，但两组间差异无显著性，实验组较假手术组小鼠活动路程减少，且差异有显著性。Morris水迷宫实验中，3组小鼠的潜伏期差异有显著性（F=16.09，P＜0.001），SNK检验显示，与假手术组相比，实验组和对照组潜伏期延长，但两组间相比潜伏期差异无显著性。结果表明，经给予minocycline抗炎处理后，血管性抑郁小鼠的抑郁行为可得到改善，但其认知能力却无明显改善（表2）。

2.2 minocycline对小鼠海马组织肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-1β、白细胞介素-6含量的影响 ELISA检测结果显示，实验组、对照组及假手术组小鼠海马组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6含量差异均有显著性（F=13.42，P＜0.001；F=18.69，P＜0.001；F=5.49，P=0.010）（图1），SNK检验显示，与对照组相比，实验组和假手术组3种促炎性细胞因子均降低，差异有显著性，实验组小鼠海马炎症因子含量稍高于假手术组，但两组差异无显著性。结果显示，minocycline对血管性抑郁小鼠海马组织中3种促炎性细胞因子的表达均有抑制作用。

2.3 minocycline对小鼠海马组织5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺含量的影响 通过对前处理方法的优化，最终选择2%的HClO4生理盐水溶解，以保证3种神经递质的化学稳定性，在此色谱条件下，3种神经递质的色谱峰完全分离，保留时间分别为1.35 min，2.65 min，4.56 min，典型的色谱图如图2所示。其标准曲线方程如表1所示，从结果看出3种化合物在此浓度范围内线性关系良好，相关系数r＞0.9990。海马组织匀浆中3种神经递质含量测定结果显示，3组样本中5-HT、DA的含量差异具有显著性（F=4.17，P=0.026；F=5.18，P=0.012），NE的含量差异无显著性（F=2.13，P=0.139）（图3）。SNK检验显示，与实验组相比，对照组和假手术组5-HT含量差异无显著性，但假手术组5-HT含量高于对照组；与对照组相比，实验组与假手术组DA含量增高，差异具有显著性，但两组间DA的含量差异无显著性。结果表明，minocycline对血管性抑郁模型小鼠海马中5-HT和NE无明显影响，但DA含量增加（图3）。

表2 minocycline对血管性抑郁小鼠抑郁行为及认知能力的影响

图1 ELISA检测2组小鼠海马组织匀浆中TNF-α、IL-1β、IL-6浓度注：A：3组海马匀浆中TNF-α含量对比，实验组与假手术组低于对照组（**P＜0.01）；B：3组海马匀浆中IL-1β含量对比，实验组与假手术组均低于对照组（**P＜0.01）；C：3组海马匀浆中IL-6浓度对比，实验组与假手术组低于对照组（*P＜0.05；**P＜0.01）；ELISA：酶联免疫吸附测定；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IL-1β：白细胞介素-1β；IL-6：白细胞介素-6

图2 高效液相色谱法检测海马匀浆中5-HT、NE、DA色谱图注：A：5-HT、NE、DA标准对照品色谱图，峰1为NE，峰2为DA，峰3为5-HT；B：海马匀浆中3种递质色谱图；5-HT：5-羟色胺；NE：去甲肾上腺素；DA：多巴胺

图3 高效液相色谱检测2组小鼠海马组织匀浆中5-HT、NE、DA含量对比注：与对照组相比，*P＜0.05；**P＜0.01；5-HT：5-羟色胺；NE：去甲肾上腺素；DA：多巴胺

3 讨论

1997年Alexopoulos首次提出“血管性抑郁”的概念，但脑血管疾病导致抑郁发生的机制不明。Alexopoulos分析了一系列临床研究后于2011年提出了血管性抑郁发病机制的“炎症反应假说”[9]，认为年龄及脑血管病相关的炎症过程介导了抑郁症状的发生。

荟萃分析发现，经典的SSRI类抗抑郁药物可降低血清中TNF、IL-1β、IL-6水平[10]，TNF-α拮抗剂依那西普和非甾体消炎药塞来昔布对重症抑郁患者的症状改善具有一定的治疗效果，但机制仍不明确[11-12]。尽管抗炎治疗抑郁的研究取得一定进展，但针对血管性抑郁的抗炎干预研究仍然较少。

第二代半合成四环素类药物minocycline可快速通过血脑屏障，抑制脑内炎症反应，其抗炎作用主要通过直接和间接地抑制中枢神经系统中小胶质细胞的激活和增殖，进而减少TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子的释放表达[13]。而前述的炎症反应抑制剂依那西普、塞来昔布仅针对部分炎性细胞因子的表达进行抑制，非特异性抗炎作用不如minocycline全面有效。本研究首先观察了给药后海马组织匀浆中的TNF-α、IL-1β、IL-6含量，结果显示给药组3种炎性细胞因子的表达明显减少，表明minocycline可以显著抑制血管性抑郁小鼠海马中炎性细胞因子的表达。

本研究采用前期研究中使用过的血管性抑郁小鼠模型，模拟缺血低灌注损伤所致的血管性抑郁，在前期工作中，本课题组在抑郁行为检测中观察到该模型小鼠较假手术小鼠具有明显的抑郁行为且不伴有神经运动功能缺损，同时在脑组织中观察到以少突胶质细胞减少为特征的脑白质损伤（white matter lesions，WMLs）[4-5]。而Sneed等[14]研究证实皮层下深部白质损伤是血管性抑郁特征性的神经病理学改变，同时也是血管性抑郁作为老年迟发性抑郁一种亚型的依据。因此，该模型能够有效地模拟血管性抑郁的病理生理状态，是研究血管性抑郁的可靠模型。本研究发现经连续给予minocycline抑制炎症反应后，实验组小鼠抑郁行为较对照组明显改善，进一步验证了TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性细胞因子在血管性抑郁发生中的重要作用。

炎性细胞因子导致抑郁发生的机制很多，其中神经递质消耗被认为是主要途径之一[15]。研究认为，炎性细胞因子TNF-α、IFN-γ激活2，3-吲哚胺双加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO），降低了左旋色氨酸水平，从而导致脑内5-HT生成减少，是炎症导致抑郁的重要分子通路[16]。炎性细胞因子还可以通过影响5-HT转运体的活性来调节突触5-HT的利用度。研究证实，IL-1β、TNF-α均可通过p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）依赖的信号通路快速激活5-HT转运体，导致突触间隙5-HT减少，这也是炎症诱发动物抑郁样行为的机制之一[17]。此外，炎性细胞因子激活的MAPK信号通路还可以提高多巴胺转运体的活性，从而使多巴胺再摄取增加致使突触间隙中多巴胺浓度降低[18]。

血管性抑郁与应激相关的抑郁有不同之处，患者易同时伴有以执行功能障碍为主的认知能力损害，且对SSRI类抗抑郁药的疗效较差[19]。本研究中，抗炎治疗尽管抑郁行为有所改善，但并不能显著提高海马匀浆5-HT和NE的含量，且DA含量明显升高，可能由于血管性抑郁的抑郁行为并非单纯基于5-HT或NE的减少，这也可能是临床上SSRI类药物疗效欠佳的原因之一，因此，临床针对血管性抑郁的患者，早期应用具有调节多巴胺受体功能的药物（如非典型性抗精神病药物），可能具有预防认知障碍的作用。这与本课题前期工作通过非典型性抗精神病药物预防血管性痴呆动物认知障碍及白质髓鞘损伤的研究结果相吻合[5]。在血管性抑郁发生过程中，炎症对DA代谢的具体调节通路及机制有待在分子生物学实验水平进一步完善和验证。

本研究的不足在于，由于用药时间较短，抗炎治疗对动物的认知恢复未观察到明显的效果，仍然不能说明抗炎治疗对认知改善无效。目前针对认知障碍前期——即可逆期的研究成为热点，本研究将进一步进行长程给药与预防性给药对认知功能的影响，为临床防治血管性认知障碍提供依据。

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【点睛】

本研究通过minocyclin抑制血管性抑郁小鼠脑内非特异性炎症反应显著改善其抑郁行为，为临床上探索此类抑郁的治疗提供了实验依据。