基于网络药理学研究灯盏花素抗胰腺癌的分子机制研究

战楚婷 张境丰 陈梦池 刘江华

灯盏细辛，为菊科植物短葶飞蓬的干燥全草，主要分布在我国云贵高原。灯盏花素（Breviscapine，BVP）是灯盏细辛主要成分之一，属于黄酮类化合物，临床上主要用于治疗心脑血管系统［1］等疾病。胰腺癌（Pancreatic cancer，PC）恶性程度高，5年生存率极低，其诊断与治疗一直是难点［2］。研究证实，BVP 有关抗肿瘤中作用，例如在胃癌中通过调控PTEN/PI3K 通路抑制上皮细胞-间充质转化［3］，在非小细胞肺癌［4］中改善耐药。而BVP 在PC 中鲜有研究。本研究利用网络药理学结合实验的模式，探讨治疗PC 的潜在靶点和初步机制，为中医药防治PC 提供理论和实践基础。

1 临床资料

1.1 靶点筛选、药物-作用靶点-通路网络的构建和富集分析通过SwissTargetPrediction 等数据库获得BVP 靶点；利用Gencard 等数据库获得PC 相关靶点。将相关靶点导入Cytoscpe3.7.2 构建药物-靶点-通路图（见图3）。将图2 中得到的靶点导入STRING（https：//string⁃db.org/）数据库，构建蛋白质相互作用（protein⁃protein interaction，PPI）网络；使用Metascape（https：//Metascape.ncifcrf.gov/）对共同靶点进行对共同靶点进行基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes.，KEGG）富集分析。

1.2 细胞培养人胰腺癌BXPC⁃3 细胞培养在温度：37℃，5%CO2，用10%胎牛血清、1%青链霉素混合液的RIPM⁃1640 培养，正常培养细胞为对照组；而相同条件下用BVP 浓度为800 μmol/L 干预BXPC⁃3 细胞为实验组。

1.3 透射电镜观察细胞超微结构收集培养48小时对数生长期对照组与实验组细胞，经入固定液4℃固定过夜，用1%的锇酸4℃下固定2 h，磷酸缓冲液PBS（PH7.4）漂洗3 次，经梯度脱水、渗透、包埋、切片、染色，最后置于电镜观察，采集图像下并分析。

1.4 流式细胞术检测凋亡收集培养48 小时对数生长期对照组与实验组细胞，各约5*105个/管。根据试剂盒说明书染色，孵育30 min。过滤后，上机检测。

1.5 WB 检测凋亡相关蛋白的表达取培养48小时对数生长期对照组与实验组细胞六孔板细胞，弃上清，PBS 洗涤，加入裂解液置于冰上，30 min后，超声、离心留上清、BCA 法检测浓度。经聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、一抗、二抗孵育，收集图像信息。

1.6 统计学分析采用SPSS 26.0 进行数据分析，符合正态分布的连续数值型变量用（±s）表示，两组间比较采用t检验；以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 BVP的化学结构式 见图1。

图1 BVP 化学结构式（3D）

2.2 BVP靶点和PC 靶点 共获得49 个BVP 作用基因靶点，4146 个PC 相关基因靶点信，利用veny 网站对共同靶点取交集后得到共同靶点30个，见图2。

图2 BVP 抗PC 韦恩图

2.3 构建药物-靶点-通路图及PPI蛋白作用网络 使用Cytoscape 3.7.2 构建药物-靶点-通路网络，见图3；对“2.2”中得到的靶点构建PPI 网络（见图4）。

图3 BVP-靶点-通路图

图4 蛋白相互作用网络图

2.4 共同靶点的富集分析本使用METASCAPE对靶点进行GO 富集分析和KEGG 通路富集分析，GO 富集分析使用气泡图进行可视化（图5），KEGG通路富集分析使用柱状图进行可视化（图6）。

图5 共同靶点GO 富集分析

图6 共同靶点KEGG 通路富集分析

2.5 透射电镜观察结果电镜下对照组细胞形态规则，细胞膜完整，细胞核较大、核膜完整、核仁清晰，线粒体结构清晰。实验组组细胞排列松散，细胞膜表面微绒毛消失，细胞核呈畸形改变，线粒体严重肿胀、嵴减少，可见的凋亡小体。（见图7）

图7 药物处理后BXPC-3 的超微结构（注：A 对照组，B 实验组）

2.6 流式细胞术细胞凋亡分析结果示对照组和实验组BXPC⁃3 细胞凋亡比率分别为（2.47±0.23）%、（58.81.84±10.01）% ；两组相比，有显著差异（P<0.05）。（见图8）。

图8 BVP 作用BXPC⁃3 细胞凋亡情况（图8a 对照组凋亡；图8b 实验组凋亡）

2.7 WB检测凋亡相关蛋白 与对照组相比，经BVP 处理48 h 后实验组BXPC⁃3 细胞抗凋亡蛋白Bcl⁃2 显著降低，TNF⁃α 表达显著升高，均有差异（P<0.05）（见图9）。

图9 Bcl⁃2、TNF⁃α 蛋白表达

3 讨 论

PC 恶性程度高，5 年生存率极低［5］。目前早期PC 治疗以手术为主，但多数患者被确诊时已丧失手术机会或治疗效果不佳［7］。有研究显示中草药在PC 治疗中发挥着延长患者中位生存时间等优势［8］。

BVP 是一种天然黄酮类化合物。研究显示BVP 具有抗癌作用［9-11］。本研究共筛选出BVP 的共同靶点30 个；通过GO 富集分析共同基因靶点在生物学过程、细胞组分和分子功能这三个方面富集的条目分别是14、6、7，可能参与免疫反应、凋亡过程、蛋白质结合、转录因子结合、酶的结合等多个方面；KEGG 通路富集分析显示共同靶点富集在6 个KEGG 信号通路，包括癌症通路、PI3K⁃AKT、HIF⁃1、MAPK、NF⁃κB、P53 等信号通路，其中PI3K⁃AKT 通路表现出较高程度的富集，表明BVP 在抗PC 中起着重要作用。有研究提示PI3K⁃AKT 的异常激活状态，会导致肿瘤更易发生侵袭和凋亡［15-16］。

研究显示PI3K⁃AKT 通路的异常激活与PC 发生发展密切相关，沉默该通路的下游基因Girdin可降低p⁃AKT 和p⁃PI3K 水平，增加PC 细胞凋亡并诱导细胞周期停滞［17］。PI3K⁃AKT 通路异常也被证实与PC 患者总生存期较差有关［19］。越来越多的证据显示，PI3K⁃AKT 通路参与调控细胞周期和凋亡［20］。本研究关注BVP 是否对PC 发挥抗肿瘤效应，基于网络药理学基础进一步验证：首先电镜下观察发现，给药后细胞体积变小，细胞膜微绒毛消失，内质网、线粒体等细胞器均发生改变，可见凋亡小体。应用流式细胞术结果显示BVP 干预后，可明显诱导凋亡。最后又通过WB 发现BVP处理后能够下调BXPC⁃3 细胞抗凋亡蛋白Bcl⁃2 表达。目前已证实：PI3K/AKT 信号传导通路可调控Bcl⁃2 家族；AKT 磷酸化Bad ，引起Bad 与14⁃3⁃3 蛋白结合，阻止其与抗凋亡蛋白Bcl⁃2 和Bcl⁃XL 的相互作用，发挥促进凋亡作用［20］；也有研究证实：体外条件下TNF⁃α 能够诱导胃癌细胞［21］的凋亡，在本研究中BVP 处理后BXPC⁃3 细胞发生凋亡，同时TNF⁃α 表达上调，二者之间可能存在某种联系，需进一步验证。综合以上，提示BVP 可能是通过抑制PI3K⁃AKT 信号通路发挥抗肿瘤效应。

总之，本研究从网络药理学和体外实验的角度，筛选BVP 治疗PC 的相关靶点及信号通路。已初步阐明了BVP 的关键靶点，推测BVP 可能通过调控PI3K⁃AKT 通路发挥抗肿瘤效应，下一步研究中将对体内实验加以验证，为BVP 治疗PC 提供更多可靠的理论依据。