DSG2F536C点突变基因敲入小鼠的心外膜电压标测与心肌纤维化

纪佳妹 郭萍 王学成 吴奕章 杨稳 周秀娟 杨兵

研究发现,一半以上的致心律失常性右室心肌病(arrhythmogenic right ventricular cardiomyopathy,ARVC)病例是由桥粒基因突变导致,因此ARVC被认为是一种“桥粒病”[1]。桥粒是由三个超基因家族成员的五种蛋白,即斑珠蛋白(PG),桥粒斑菲素蛋白2(PKP2),桥粒芯糖蛋白2(DGS2),桥粒斑蛋白(DSP),桥粒胶蛋白(DSC)相互铆合形成桥粒连接,以保证心肌细胞间机械连接,抵抗机械压力和牵张,同时具有信号传导和参与细胞凋亡等作用[2]。2006年有研究首次发现DSG2 基因突变与ARVC 发病相关[3]。近些年关于DSG2的转基因或基因敲除动物模型等研究也进一步证实DSG2基因突变可以导致ARVC的发生[4]。

本中心前期在一个较大的ARVC家系(共5代32个成员)中发现一个新的、高度保守的DSG2基因突变位点F531C[5]。我们课题组前期构建了DSG2F536C点突变敲入小鼠模型,表达出包括心功能下降和心肌纤维化等符合ARVC 病理生理改变的表型[6]。室性心律失常作为ARVC的重要临床表现之一,其形成机制研究相对较少。笔者研究DSG2F536C点突变基因敲入小鼠心外膜标测电压与心肌纤维化之间的关系,探索心外膜电压变化与心肌纤维化的潜在关联,为ARVC室性心律失常的机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 构建DSG2F536C小鼠模型 根据课题组前期研究提供的患者DSG2-F531C 突变,通过小鼠染色体定位,由南京大学模式动物研究所采用基因敲入技术,通过同源重组构建引入DSG2-F536C 点突变(人染色体DSG2-F531C 点突变位点对应小鼠染色体的DSG2-F536C 点突变位点)至胚胎干细胞(ES);筛选出阳性ES细胞克隆行囊胚注射,通过毛色筛选嵌合率大于50%的雄性嵌合小鼠。雄性嵌合小鼠与C57BL/6J雌鼠进行交配,获得纯C57BL/6J 背景的DSG2F536C杂合小鼠(Het),最后以DSG2F536杂合雌雄小鼠自交,获得野生型(WT)和纯合子(Hom),从而成功构建了DSG2F536C小鼠模型。实验分为三组:野生型组(WT)、杂合子突变组(Het)和纯合子突变组(Hom),每组各6只10周龄小鼠。所有实验均通过南京医科大学实验动物福利伦理审查(编码:IACUC-14030160)。

1.2 小鼠心外膜标测 各组小鼠称重后将戊巴比妥钠75 mg/kg腹腔内注入进行麻醉。麻醉后的小鼠行气管内插管,接入小动物呼吸机,给予人工通气。沿胸骨左缘第二肋间处剪开皮肤,撑开器撑开胸廓,充分暴露心脏,移除心包,以两片标测电极(自制)分别紧贴在心脏左、右室表面,接入信号采集系统(Powerlab多导生理记录仪系统),记录心外膜标测电压,选取连续3个基线平稳的心电波形,用Matlab分析系统(Mathworks公司,美国),分析每个电极片的32个电压数值,取32个电压中最高者,计算3个心电波最高电压的平均值为该参数测量值。

1.3 心室纤维化检测 10周龄的小鼠断颈处死后分离心脏挤出残余血液,4%多聚甲醛固定过夜,常规取材,脱水,石蜡包埋,石蜡切片5μm;石蜡切片脱蜡复水;Weigert苏木精液染核5～10 min;充分水洗;猩红液染1 min;蒸馏水洗;磷钼酸磷钨酸水溶液分化10 min,直到胶原不再呈红色;不经水洗,直接用苯胺蓝染5 min;蒸馏水洗;55℃烘片、二甲苯透明、中性树胶封固。应用Image Pro Plus 6.0分别测量左、右室胶原纤维染色面积占镜下视野总面积的比例,胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)等于胶原面积/视野总面积。

1.4 统计学方法 计量资料用均数±标准差表示,采用SPSS-20.0统计分析软件进行统计分析,对于三组实验数据之间采用单因素方差分析。图形绘制使用Graphpad Prism 5.0 软 件 完 成。以P＜0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 三组心外膜电压标测的比较 Hom 组右室单极电压最高值较WT 组、Het组小鼠显著降低,右室双极电压最高值较WT 组显著降低。三组的左室单极和双极电压最高值无差异(表1,图1)。与WT 组和Het组相比,Hom 组右室的CVF 明显增加,三组左室CVF均无差异(表1)。

图1 三组心室单极和双极电压心外膜标测图

表1 三组心外膜标测心室单极和双极电压最高值数据与心室胶原容积分数

2.2 三组心室纤维化比较 WT 组小鼠左、右室心肌结构清晰,排列有序,心肌细胞间隙未见胶原纤维沉积。Het组仅出现左、右室心肌细胞排列稍紊乱,心肌细胞间隙未见胶原纤维沉积。Hom 组小鼠右室心肌排列紊乱,正常心肌组织被大量胶原纤维取代(图2)。

图2 三组的Masson染色

3 讨论

目前ARVC的消融治疗中,针对心外膜低电压区的片状消融是一重要方向。通过标测心脏表面电压,判断心肌瘢痕区域,从而进行消融[7]。临床上心室双极电压＜0.5 m V 的区域标记为瘢痕区,＞1.5 m V 的为正常心肌,0.5～1.5 m V 为病变移行区[8]。通过在体心外膜标测方法,单极电压反映的是整个心室的电活动;而常规的双极电压反映的是局部的电活动,排除了远离电极部位电活动的影响[9]。所以两者可以相互补充,提供心肌局部电位和远场电位的信息,从而提高电生理标测的准确性。本研究中,Hom 组小鼠右室心外膜单极和双极电压比野生型小鼠显著降低,提示纯合模型小鼠右室瘢痕的存在是形成折返环、引起快速性心律失常的基础。而Hom 组小鼠左室单极和双极电压与野生型相比也出现了降低,但未出现统计学差异,可能与ARVC累积左、右室的进程差异相关。

为了研究DSG2所致ARVC的致病机制,近些年来有不同的疾病模型得以建立。在高表达型DSG2N271S突变的转基因小鼠中,大于5周龄的小鼠均出现心室的纤维化取代正常心肌组织[10]。其他研究也构建了DSG2蛋白EC1-2的基因敲除小鼠,12周龄后所有小鼠均出现肉眼可见的纤维瘢痕改变,而杂合子小鼠无上述病理表型[11]。本研究中Hom 组小鼠出现以右室为主的心室纤维化,而Het组小鼠未出现类似的病理改变,仅出现右室心肌细胞排列紊乱,而随着小鼠周龄的增加,Het小鼠是否会出现类似于Hom 组小鼠的病理表型,还需进一步观察更大周龄的小鼠的病理表型特征。

在本研究中,DSG2F536C点突变基因敲入纯合子小鼠在10周龄时右室心外膜单、双极电压均明显降低,心肌纤维化程度显著。左室纤维化不明显,相应电压标测也未测得显著差异,提示心外膜电压变化与心肌纤维化存在潜在关联。