IRS1基因rs7578326位点多态性与2型糖尿病合并高甘油三酯关联研究

武志凤，金 花，吴英博，刘玉娇，韩立坤，白海花

（1.内蒙古民族大学 生命科学与食品学院，内蒙古 通辽 028043；2.内蒙古自治区个体化用药工程技术研究中心，内蒙古 通辽 028000；3.内蒙古民族大学 附属医院，内蒙古 通辽 028000）

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种以高血糖为特征的代谢性慢性疾病，其中，以2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）占比最大，且患病率逐年增加[1］。据相关研究表明，T2DM主要由遗传因素和环境因素相互作用而引起，其主要特征是胰岛素抵抗[2-3］。血脂的升高将进一步促进胰岛素抵抗的发生，致使T2DM合并高甘油三酯的风险提高。血脂异常一般表现为总胆固醇（Total Cholesterol，TC）、甘油三酯（Tri⁃glycerides，TG）及低密度脂蛋白胆固醇（Low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）的升高和（或）高密度脂蛋白胆固醇（High density lipoprotein cholesterol，HDL-C）的降低等[4］。T2DM在遗传方面存在种族异质性，其发病率存在明显差异[5］。在被胰岛素刺激的肝瘤细胞浆的研究中发现IRS1基因是分子量为185 kDa亲水性蛋白，现已成功得到克隆[6-7］。IRS1基因产物主要分布在胰岛素外周组织和器官中，在调节胰岛素信号通路中有6个信号转导蛋白（Tyr-Met-X-Met）起关键作用[8-9］。单核苷酸多态性与T2DM的遗传易感性已被大多数的试验所证实[10］。据先前候选基因测序的研究中发现，在蒙古族T2DM人群中IRS1基因存在独特的多态性位点，即IRS1rs7578326位点[11］。目前，对蒙古族IRS1基因多态性与2型糖尿病合并高甘油三酯的相关性研究鲜有报道。笔者通过本研究试图分析并进一步验证IRS1rs7578326位点与蒙古族患者2型糖尿病合并高甘油三酯的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

选取2020年9月—2021年12月在内蒙古东部地区地方医院就诊的71例蒙古族糖尿病患者作为病例组（T2DM组），包括男性26例，女性45例，平均年龄（53.83±10.83）岁。选取78例蒙古族无糖尿病、无高血脂的健康人群作为正常对照组（NC组），包括男性23例，女性55例，平均年龄（45.69±9.61）岁。选取95例蒙古族T2DM 合并高甘油三酯患者（T2DM+高TG 组），包括男性42 例，女性53 例，平均年龄（53.53±10.52）岁。选取93例蒙古族高甘油三酯患者，包括男性41例，女性52例，平均年龄（44.49±15.51）岁。以上4组均为蒙古族，且个体间没有血缘关系。根据WHO 诊断标准：空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）≥7.0 mmol·L-1可诊断为T2DM；根据2016 年修订版《中国成人血脂异常防治指南》中的高血脂症诊断标准：甘油三酯（TG）≥1.70 mmol·L-1，并排除患有严重心、肾、肝等疾病的患者。健康组纳入标准：按照年龄及性别进行匹配，血脂7项+葡萄糖检测无明显异常者。入组对象均自愿参加本项研究并积极配合，并知情同意和签署知情同意书。

1.2 研究方法

1.2.1 信息采集 使用统一设计的流行病学调查问卷分别对4组人群进行问卷调查，调查内容包括：一般人口学资料、饮酒史、饮食等生活习惯，个人史、家族史等；收集身高、体重、腰围、血压等基本人体指标以及计算体质指数（Body mass index，BMI）=体重（kg）/[身高（m）］2。

1.2.2 提取基因组DNA 对所有研究对象均采集外周血5 mL，采用酚/氯仿法提取外周血基因组DNA。具体为，3 mL血液样本倒入50 mL离心管中，加入10倍体积的蒸馏水，4 ℃5 000 r·min-1离心10 min，重复2 次后加入生理盐水20 mL，4 ℃下5 000 r·min-1离心10 min，用以破红细胞，另外再加入TES 4 mL、10% SDS 300 μL 及蛋白酶K 100 μL，并过夜消化用以破白细胞，次日再用酚、氯仿抽提细胞总DNA，最后加入200 μL ddH2O用于保存所提取的DNA。随后置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.3 PCR扩增与基因多态性检测 用Primer5.0设计PCR引物（表1），将设计好的引物进行BLAST检测，再进行PCR扩增反应。PCR反应总体系为50 μL，含10×Taq PCR Buffer 5.0 μL，2.5 mM dNTP 2.5 μL，上游引物、下游引物各2.0 μL，DNA 模板2.0 μL，0.5 μL 的Taq 酶以及ddH2O 36.0 μL。在普通PCR 仪中进行扩增，扩增程序如下：设置95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

表1 rs7578326扩增片段序列Tab. 1 Amplified fragment sequence of rs7578326

PCR产物的检测及基因多态性检测：PCR扩增产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，以DNA分子量标准Marker（100~2 000 bp）标准物作为参照。目的条带经过纯化用于Sanger 测序，进行IRS1基因rs7578326位点的基因多态性检测。

1.3 血脂生化指标检测

测定T2DM相关指标，氧化酶法检测（口服75 g葡萄糖）2 h 血浆葡萄糖浓度（2h-PG）：3.9~6.1 mmol·L-1。总胆固醇（TC）<5.6 mmol·L-1、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）：0.19~1.55 mmol·L-1、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）<3.12 mmol·L-1、甘油三酯（TG）<1.70 mmol·L-1，以上生化指标检测均由内蒙古民族大学附属医院检验科完成。

1.4 统计学处理

利用SPSS 21.0 统计学软件进行统计分析。T2DM+高甘油三酯组、T2DM 组、高甘油三酯组、对照组与Hardy-Weinberg平衡的符合程度，采用χ2检验对基因型和等位基因频率进行比较分析，符合正态分布的计量资料用±s表示。组间差异比较使用单因素方差分析（ANOVA）、t检验或协方差分析检验，计数资料用百分比表示。通过单因素Logistic回归分析组间等位基因或基因型的关联性。

2 结果

2.1 一般资料及生化指标比较结果

选取蒙古族T2DM组71例、正常对照组78例、高甘油三酯组93例、T2DM+高甘油三酯组95例为研究对象，进行一般资料及生化指标比较。T2DM组和T2DM+高甘油三酯组研究对象的平均年龄高于正常对照组，TC、LDL-C的平均水平均高于正常对照组，结果比较差异均有统计学意义（P<0.05）。T2DM+高甘油三酯组TC、TG的平均水平均高于T2DM组，HDL-C的平均水平低于T2DM组。T2DM+高甘油三酯组的平均年龄、TG、LDL-C的平均水平均高于高甘油三酯组，结果比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 4组一般资料及生化指标比较（±s）Tab. 2 Comparison of general information and biochemical indexes of the four groups（±s）

表2 4组一般资料及生化指标比较（±s）Tab. 2 Comparison of general information and biochemical indexes of the four groups（±s）

注：与NC 组比较*P<0.05；与T2DM 组比较#P<0.05；与高甘油三酯组比较▲P<0.05。BMI：体质指数（body mass index）；SBP：收缩压（systolic pressure）；DBP：舒张压（diastolic pressure）；WC：腰围（waistline）；TC：总胆固醇（total cholesterol）；TG：甘油三酯（triglyceride）；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol）；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol）。

DBP/mmHg 83.77±15.23*76.94±11.49 82.03±11.73*82.33±17.10*LDL-C/（mmol·L-1）2.78±1.47*▲2.31±0.58 2.34±0.56 2.70±0.82*▲组别T2DM组NC组高甘油三酯组T2DM+高TG组组别T2DM组NC组高甘油三酯组T2DM+高TG组例数/（男/女）71（26/45）78（23/55）93（41/52）95（42/53）WC/cm 88.66±11.27*▲84.12±9.55 99.43±10.20*90.80±11.36*▲年龄/岁53.83±10.83*▲45.69±9.61 44.49±15.51 53.53±10.52*▲TC/（mmol·L-1）4.31±0.85*3.99±0.63 4.53±0.55*4.62±0.76*#BMI/（kg·m-2）25.11±5.08 24.11±3.48 25.73±4.21*25.85±3.84*TG/（mmol·L-1）1.34±0.24▲1.21±0.26 2.78±1.30*3.13±1.66*#▲SBP/mmHg 140.11±26.32*121.31±19.37 133.34±23.41*136.54±25.93*HDL-C/（mmol·L-1）1.40±0.35*▲1.24±0.19 1.13±0.25*1.10±0.19*#

2.2 IRS1基因多态性检测结果

2.2.1 基因组DNA与PCR扩增产物

提取的基因组DNA（见图1A），PCR扩增产物目的片段为345 bp（见图1B）。质检结果较好。

图1 1%琼脂糖凝胶电泳图Fig. 1 Diagram of 1% agarose gel electrophoresis

2.2.2 PCR产物测序

将PCR扩增产物进行Sanger测序，IRS1基因rs7578326位点基因型分为野生型AA，杂合突变型AG，纯合突变型GG。测序结果见图2。

图2 IRS1基因rs7578326位点测序图谱Fig. 2 Sequencing map of rs7578326 site of IRS1 gene

2.2.3IRS1基因rs7578326位点的基因型与等位基因频率比较

IRS1基因rs7578326位点基因型和等位基因分布频率的组间比较：所有组别的基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡（P>0.05）。IRS1基因rs7578326位点的等位基因为A、G 。T2DM+高甘油三酯组rs7578326位点A等位基因频率为85.8%，G等位基因频率为14.2%，AA、AG和GG基因型频率分别为75.8%、20.0%、4.2%；NC组A等位基因频率为76.3%，G等位基因频率为23.7%，AA、AG和GG基因型频率分别为57.7%、37.2%、5.1%；高甘油三酯组A等位基因频率为83.3%，G等位基因频率为16.7%，AA、AG和GG基因型频率分别为71.0%、25.0%、4.0%。与对照组相比，T2DM+高甘油三酯组和高甘油三酯组基因型频率和等位基因频率差异有统计学意义，且A等位基因的频率较NC组显著升高（P<0.05）。T2DM组rs7578326位点A等位基因频率为76.1%，G等位基因频率为23.9%，AA、AG和GG基因型频率分别为63.4%、25.4%、11.2%，T2DM组与NC组之间基因型频率和等位基因频率差异无统计学意义（P>0.05）。各组的IRS1基因rs7578326位点基因型和等位基因分布频率见表3。

表3 4组IRS1 rs7578326位点的基因型及等位基因频率分布及比较[n（%）］Tab. 3 Distribution and comparison of genotype，allele frequency at IRS1 rs7578326 of the four groups[n（%）］

2.2.4 组内IRS1基因rs7578326位点的不同基因型与生化指标的比较

组内IRS1基因rs7578326位点的不同基因型与生化指标的比较：在统计中将AG和AA基因型合并，作为A等位基因的携带者与GG基因型比较。在T2DM+高甘油三酯组中AA+AG 型人群TG、LDL-C水平均高于GG型，差异有统计学意义（P<0.05）。NC组AA+AG 型人群LDL-C、TG水平均低于GG型，差异有统计学意义（P<0.05）。高甘油三酯组AA+AG 型人群TC、TG、LDL-C水平均高于GG型，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

表4 组内不同基因型生化指标比较结果（±s）Tab. 4 Comparison of biochemical indexes of different genotypes in the group（±s）

表4 组内不同基因型生化指标比较结果（±s）Tab. 4 Comparison of biochemical indexes of different genotypes in the group（±s）

注：携带A等位基因与GG型比较，*P＜0.05。

检测指标/（mmol·L-1）TC TG HDL-C LDL-C T2DM组GG（n=8）4.20±0.93 1.32±0.27 1.41±0.36 2.80±1.80 AA+AG（n=91）4.62±0.75 3.38±1.97*1.10±0.19 2.72±0.82*AA+AG（n=63）4.51±0.66 1.36±0.19 1.39±0.32 2.73±0.56 NC组GG（n=4）3.97±0.36 1.32±0.16 1.33±0.08 2.64±0.26 AA+AG（n=74）3.99±0.64 1.20±0.27*1.24±0.19 2.30±0.59*高甘油三酯组GG（n=4）4.28±0.73 2.01±0.27 1.08±0.36 2.11±0.79 AA+AG（n=89）4.54±0.55*2.81±1.32*1.13±0.25 2.36±0.55*T2DM+高甘油三酯组GG（n=4）4.53±1.12 3.01±1.57 1.15±0.16 2.38±0.84

3 讨论

糖尿病是一种由胰岛素分泌异常和胰岛素活性异常所导致的代谢性综合性疾病，一般伴随糖、蛋白质和脂肪等代谢紊乱的高血糖症状，其中，2型糖尿病（T2DM）占整个糖尿病人群的80%~90%[12］。近些年来，我国蒙古族人群糖尿病患病率也呈明显增高趋势[13-14］。T2DM的特征主要表现为胰岛素抵抗，胰岛素受体底物1（IRS1）是胰岛素受体酪氨酸激酶底物，是介导胰岛素信号传导途径的关键蛋白[15-16］。目前有研究认为，胰岛素受体底物（IRSs）家族与T2DM发病相关，IRS1基因作为一个重要的候选基因，在2型糖尿病发病机制研究方面较为深入[17］。本研究显示，T2DM+高甘油三酯组和T2DM组TC、LDL-C的平均水平均高于正常对照组，结果比较差异均有统计学意义（P<0.05）。T2DM+高甘油三酯组TC、TG的平均水平均高于T2DM组，HDL-C的平均水平低于T2DM 组。T2DM+高甘油三酯组的平均年龄、TG、LDL-C 的平均水平均高于高甘油三酯组，结果比较差异均有统计学意义（P<0.05）。T2DM组与对照组相比，腰围、舒张压和收缩压差异显著（P<0.05），说明腹型肥胖和高血压可能是蒙古族T2DM患病的主要因素，以往也有相关研究证明SBP是T2DM 的危险因素[12］，与本研究结果一致。又因蒙古族人群饮食上更易偏好饮酒、喜食奶制品及肉类等，致使所摄入的脂肪过量，同时也受环境因素的双重影响，容易发生肥胖和血脂异常等情况。同时，本研究结果显示，T2DM+高甘油三酯组rs7578326 位点等位基因A、G 的频率分别为85.8%、14.2%，AA、AG 和GG 基因型频率分别为75.8%、20.0%、4.2%，NC 组等位基因A、G 的频率分别为76.3%、23.7%，AA、AG和GG基因型频率分别为57.7%、37.2%、5.1%，高甘油三酯组等位基因A、G的频率分别为83.3%、16.7%，AA、AG和GG基因型频率分别为71.0%、25.0%、4.0%。与对照组相比，T2DM+高甘油三酯组和高甘油三酯组基因型频率和等位基因频率差异显著，且A等位基因的频率较NC组显著升高（P<0.05）。在T2DM+高甘油三酯组中，AA+AG 型人群TG、LDL-C 水平显著高于GG 型，高甘油三酯组AA+AG 型人群TC、TG、LDL-C 水平均高于GG 型，NC 组AA+AG 型人群LDL-C、TG 水平均低于GG 型，说明SNP rs7578326位点多态性可能与患者脂质的代谢相关。此前有研究表明，2型糖尿病伴甘油三酯增高者会加重胰岛素抵抗[18］，因极低密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯产生得过多和清除缺陷会使病情加重，因此，更加需要注重糖尿病血脂异常的防治工作。

综上所述，本研究显示T2DM+高甘油三酯组等位基因A的频率较NC组显著升高，且A等位基因频率与TG水平呈正相关，故推测IRS1基因rs7578326位点等位基因A与蒙古族2型糖尿病合并高甘油三酯关联，其具体的基因功能以及发病机制有待进一步研究。