镉胁迫对大豆细胞周期G2/M阻滞调控的影响

曹霞，王春雷，李志刚，崔天宇，王晓东

（1.内蒙古民族大学 农学院，内蒙古 通辽028043；2.通辽市农牧业科学研究所，内蒙古 通辽028000）

大豆（Glycine max）起源于中国，是全球主要栽培的农作物之一，栽培大豆是野生大豆（G.soja）经历了5 000多年的时间驯化而来的［1］，截止到目前，在大豆重要农艺性状方面，关于基因克隆和基因功能解析等已有较多研究［2-5］.随着工业的迅速发展，我国土壤受重金属污染日趋严重，其中最为明显的是镉（Cd）污染，有研究发现，Cd对植物的毒害效应在很多方面都有表现，例如抑制种子萌发、影响细胞分裂、幼苗生长、植物的代谢（如水分代谢、矿质营养、光合与呼吸等）、破坏活性氧的防御系统等［6-8］.镉胁迫还会导致大豆叶片畸形、变黄，茎秆、叶脉和叶片呈红褐色，植株矮化、茎秆纤细、生长缓慢、枯萎死亡.ANDRES等［9］和SCEBBA等［10］研究指出，镉胁迫不仅能引起大豆基因组DNA甲基化水平和模式的改变［11］，还对基因产生毒性.LIU等［12］和吴庆钰等［13］研究分别指出，随着Cd浓度的增加，大麦根尖基因组DNA的RAPD图谱（包括RAPD谱带的缺失、增加及其荧光强度）和水稻叶片DNA的损伤均发生显著变化，这些变化可能直接或间接与细胞周期的调控机制有关.到目前为止，有关细胞周期调控机制的报道很少，大部分研究集中在各种目标基因功能的鉴定及表达，如CIPK基因［14］、GmMP基因［15］、Gm DAO1基因［16］，或者是基因家族全基因组的鉴定和分类，如OSCA基因家族［17］、KUP/HAK/KT钾转运体基因家族［18］、DNA甲基化酶的分析［19］等，而ROBERT等［20-21］研究表明，Cd胁迫引起大豆悬浮液细胞周期基因CyclinB1和CDK-A的表达差异，导致DNA损伤，细胞周期阻滞期发生在G1/S期和G2/M期，但是对于其损伤反应和细胞周期阻滞调控机制尚不清楚，而DNA错配修复系统中MSH2和MSH6蛋白能够识别由Cd胁迫引起拟南芥DNA损伤，并参与细胞周期调控，那么在大豆中是否也是如此，目前鲜见报道.本试验选取2个对Cd有不同耐性的品种，分析Cd胁迫对大豆细胞周期阻滞调控的影响，研究细胞周期阻滞发生的时期和相关基因表达的相关性，以期为大豆抗性育种、遗传改良育种提供潜在的基因突变风险评估.

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料由沈阳农业大学大豆研究所提供，分别为“辽豆10号”（对Cd敏感）和“沈农豆20”（对Cd顿感）.

1.2 试验设计

采用培养皿双层滤纸培养法.Cd浓度分别设为0、0.25、0.50和2.50 mg·L-1等4个梯度，每个浓度重复5次，共40个处理；放置于光照培养箱里25±1℃培养4 d，光周期为16 h/8 h.

1.3 测定指标及方法

1.3.1 幼苗形态指标测定及方法

取不同Cd浓度处理下的大豆幼苗，观察发芽情况，计算发芽率；分别测量其根长、鲜重，计算根长抑制率，公式如下：n=（1-x/y）×100%（式中，x为各处理组幼苗初生根平均根长；y为对照组幼苗初生根平均根长）.

1.3.2 细胞周期测定及方法

取不同Cd浓度处理后的幼苗，剪取根尖（约0.5 cm），用滤纸吸干水分后放入盛有200 μL细胞核解离液的培养皿中，迅速用锋利的刀片将其切碎，转移到2 mL的离心管中，室温下静置5~10 min，然后过50 μm和30 μm的尼龙筛，向滤液中加入解离液体积1.4倍的DAPI（Partec，Germany）染液，室温下暗处放置30~45 min，然后采用倍性分析仪CyFlow flow cytometer（Partec，Germany）在365 nm波长处进行测定.

测定结果使用Flowjo 10 win 64 software（BD Biosciences，San Jose，CA）进行分析.

1.3.3 大豆幼苗根尖RNA提取和qRT-PCR测定及方法

（1）总RNA提取：采用RNA提取试剂盒，名称为EZ-10DNAaway RNA Mini-prep Kit，用蛋白质核酸分析测定仪测定OD260/OD280和OD260/OD230的比值来确定所提取RNA的纯度，并用1%的普通琼脂糖凝胶电泳在120～130 V的电压下快速电泳检测RNA的完整性.

（2）RNA反转录cDNA：采用cDNA试剂盒，名称为PrimeScriptTM 1st strand cDNA Sythesis kit.

（3）PCR扩增体系采用SYBR Green Mix：20 μL反应体系为SYBR（缓冲液）10 μL，RF（引物）2 μL，cDAN模板量1 μL，无菌水7 μL.

（4）PCR扩增流程：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，75℃退火5 s，40个循环，60℃延伸10 min.

每个反应结束后采集荧光，每个处理做3个重复，并建立实时扩增曲线和溶解曲线.上述基因转录水平变化的计算公式为：2-△△Ct，其中，△△Ct=（Ct target-Ct control）Sample2-（Ct target-Ct control）Sample1.以大豆UBQ10基因为内参基因，所用引物序列见表1.PCR扩增后用QPCR分析数据模板进行基因表达的变化规律分析.

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.3.4 根尖DNA提取及RAPD测定

（1）DNA提取采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（CW0531）（北京康维世纪生物科技有限公司）提取幼苗根尖全基因组DNA.使用核酸蛋白仪测定其纯度及含量，用1%琼脂糖凝胶电泳及Takara DL2000 DNA Marker进行含量校准及其完整性检测.

（2）RAPD分析方法参照LIU等［23］和李珊珊［24］，引物选用Primer 3和Primer 11（表2）.

表2 试验中使用的2种随机引物序列Tab.2 Two random primer sequences used in the experiment

1.4 数据处理分析

采用SPSS软件（版本20.0）和Microsoft Excel 2003进行数据统计分析.

2 结果与分析

2.1 Cd胁迫对大豆幼苗根长生长的影响

与对照组相比，辽豆10号处理组的鲜重除了在Cd浓度为2.50 mg·L-1时达到了显著性差异（P<0.05）外，其他均无显著差异，发芽率均无显著差异，而沈农豆20处理组的发芽率和鲜重均没有达到显著性差异；与对照组相比，辽豆10号和沈农豆20处理组的根长均达到了显著性差异（P<0.05）；辽豆10号的根长+胚轴在Cd浓度为0.50和2.50 mg·L-1时达到了显著性差异（P<0.05），而沈农豆20则是在Cd浓度为0.25 mg·L-1达到了显著性差异（P<0.05）；在Cd浓度为0.25 mg·L-1时辽豆10号和沈农豆20均表现为促进作用，其抑制率分别为-13.42%和-15.67%，在0.50 mg·L-1和2.50 mg·L-1Cd处理下辽豆10号和沈农豆20均表现为抑制作用，抑制率分别为25.92%、54.21%和19.52%、23.64%，根长与Cd水平呈明显的倒U字型—剂量关系（表3），说明辽豆10号较沈农豆20对Cd毒性更敏感.

表3 Cd胁迫对大豆发芽率、根长、鲜重的影响Tab.3 Effects of Cd stress on germination，root length，and fresh weight of soybean

2.2 Cd胁迫对大豆根尖细胞周期阻滞调控的影响

辽豆10号在Cd胁迫下其根尖细胞核DNA含量分布比例在2C（细胞核内有2组DNA）水平呈递增变化，DNA含量比例的增加量达5%~50%，4C（4个组DNA数目）呈递减变化，均有显著性差异（P<0.05），而8C（8个组DNA数目）水平DNA含量分布比例无显著变化，说明在Cd胁迫下辽豆10号（敏感型）幼苗根尖细胞周期是被阻滞在G1/S期（图1a）；沈农豆20根尖细胞核DNA含量分布比例在2C水平呈递减变化，4C呈递增变化，且DNA含量比例的增加量达13%~18%，而8C水平DNA含量分布比例同样没有达到显著性差异，说明沈农豆20（钝感型）幼苗根尖细胞周期是被阻滞在G2/M期（图1b）.试验结果表明，在受Cd胁迫后，对重金属Cd耐性不同的品种，其细胞周期阻滞的时期也不相同，这可能与品种本身对Cd胁迫应答反应机制及抵御胁迫机制不同有关.

图1 FCM流式细胞术对Cd（0~2.50 mg·L-1）处理4 d后的大豆根尖细胞核DNA含量分析Fig.1 Analysis of nuclear DNA content in root tips of soybean seeds Liaodou 10 and Shennongdou 20 treated with CD（0~2.50 mg·L-1）for 4 d by FCM flow cytometry

2.3 与细胞周期相关基因的qRT-PCR表达分析

2.3.1 Cd胁迫影响大豆幼苗根尖细胞周期G2/M期相关基因表达

辽豆10号细胞周期G2/M期相关的基因表达呈递减的变化趋势，CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表达量随着Cd浓度的增加呈下调变化趋势，除了WEE1基因的0.25 mg·L-1Cd处理外，其他处理达到了显著或极显著差异（P<0.05或P<0.01），其中，在2.50 mg·L-1Cd处理下，CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表达量分别较对照组下调了0.749、0.878和0.564（图2a）；沈农豆20的细胞周期G2/M期相关的基因表达与辽豆10号呈现不同的变化趋势，与对照组相比，CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表达量在0.25 mg·L-1Cd胁迫下显著增加，达到极显著性差异（P<0.01），其增加量分别是对照组的1.6倍、5.5倍和1.5倍，随着镉浓度的增加，其表达量显著降低，整体来看，随着Cd胁迫浓度的增加，CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表达量呈典型的倒U型，与辽豆10号对照组相比，在0~2.50 mg·L-1Cd处理下CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表达量均显著降低，0~0.50 mg·L-1Cd处理下降低量在对照组0.107~0.723之间，而在2.50 mg·L-1Cd处理下，CYCB1；1、WEE1和CyclinB基因的表达量分别降低到对照组的0.052、0.071和0.187（图2b）.试验结果表明，Cd胁迫下沈农豆20根尖DNA损伤修复能力较辽豆10号强，其中有一部分参与G2/M期阻滞.

图2 Cd胁迫4 d后对大豆幼苗根尖细胞周期相关基因转录水平表达的影响Fig.2 Effect of Cd stress on cell cycle related gene expression in root tips of soybean seedling after 4 d

2.3.2 Cd胁迫影响大豆幼苗根尖DNA损伤相关基因表达

关于DNA损伤修复基因RAD51、MRE11和KU70的表达量，辽豆10号和沈农豆20表现出相似的变化规律，即除了沈农豆20的RAD51基因之外，基因RAD51、MRE11和KU70的表达量与Cd浓度呈典型的倒U型剂量-效应关系，在0.25 mg·L-1Cd胁迫下，辽豆10号和沈农豆20较对照组均增加，增加量为1.4~2.0倍.随着Cd浓度的增加，辽豆10号表达量均受到抑制，呈下调趋势，在2.50 mg·L-1Cd时均达到极显著性差异（P<0.01），其中，RAD51和MRE11基因的表达量仅为对照组的0.108和0.288（图3a）.而沈农豆20的RAD51基因表达量随Cd浓度的增加呈递减变化趋势，下调比例在0.2~0.8之间，MRE11和KU70基因表达量则呈典型的倒U型，在0.25~0.50 mg·L-1Cd时表现为增加，达到了显著性差异；与辽豆10号对照组相比，RAD51基因的表达量在0 mg·L-1Cd时表现为增加，但无显著差异，随着Cd浓度（0.25~2.50 mg·L-1）的增加其表达量均表现为下降；MRE11基因的表达量随着Cd浓度（0.25~2.50 mg·L-1）的增加表现为上调，KU70基因的表达量随着Cd浓度（0.25~2.50 mg·L-1）的增加表现为先上调后下调的变化，上调量是对照组的1.4~1.9倍（图3b）；试验结果表明，Cd胁迫对辽豆10号和沈农豆20幼苗根尖细胞DNA均能够造成严重的损伤，主要包括非同源末端连接（NHEJ）和同源重组（HR），并且有一部分参与细胞周期阻滞.

图3 Cd胁迫4 d后对大豆幼苗根尖DNA损伤修复基因转录水平表达的影响Fig.3 Effects of Cd stress on DNA damage repair genes expression in root tips of soybean seedling after 4 d

2.3.3 Cd胁迫影响大豆幼苗根尖MMR相关基因表达

辽豆10号DNA错配修复基因MLH1、MSH2和MSH6的表达量随Cd浓度的增加均表现为下调，且达到显著性差异，在2.50 mg·L-1Cd处理下，基因MLH1、MSH2和MSH6的表达量下调分别仅为对照组的0.191、0.128和0.261（图4a）.沈农豆20的DNA错配修复基因MLH1和MSH6基因的表达量在0.25~2.50 mg·L-1Cd浓度胁迫下与对照组相比均表现为下调；而MSH2基因的表达量与Cd浓度呈典型的倒U型剂量-效应关系，在0.25 mg·L-1Cd时上调量为1.11倍，在0.50~2.50 mg·L-1Cd时MSH2和MSH6基因的表达量下调达到极显著差异，其中，MSH2基因下调到对照组的0.342和0.123，而MSH6基因下调到对照组的0.112和0.085；与辽豆10号对照组相比，MLH1基因的表达量在0~2.50 mg·L-1Cd胁迫下均显著降低，其中，在2.50 mg·L-1Cd浓度处理下调量仅是对照组的0.204，MSH2基因表达量在0.25 mg·L-1Cd时上调了约1.3倍，0.50~2.50 mg·L-1Cd时，MSH2和MSH6的表达量均显著降低，且在2.50 mg·L-1Cd时达到最小，仅为对照组的0.14（图4b）.试验结果表明，Cd胁迫都能引起辽豆10号和沈农豆20根尖细胞DNA的损伤，但是在2个品种间这些基因的表达量达到显著差异，说明Cd胁迫对不同的品种造成DNA损伤类型是不同的.

图4 Cd胁迫4 d后对大豆幼苗根尖DNA错配修复基因转录水平表达的影响Fig.4 Effects of Cd stress on DNA mismatch repair genes expression in root tips of soybean seedling after 4 d

2.4 Cd胁迫对辽豆10号和沈农豆20基因组DNA多态性（RAPD）分析

与对照组相比，在0.25 mg·L-1Cd胁迫下，辽豆10号和沈农豆20幼苗根尖中可检测出的条带数分别为5和11.5，达到显著差异，在0.50 mg·L-1Cd胁迫下，辽豆10号和沈农豆20幼苗根尖中可检测出的条带数分别为6.5和13，在2.50 mg·L-1Cd胁迫下，可检测出的条带数分别为8和17（图5）.试验结果表明，中低浓度的Cd处理就已经对基因组DNA造成了一定的损伤，而高浓度Cd处理对基因组DNA造成的则是直接性损伤，这种损伤很难修复，从而增加了基因组的不稳定性.Cd胁迫下RAPD图谱中辽豆10号和沈农豆20检测到不同的多态性条带数，说明辽豆10号DNA损伤不会导致继发性的形成；而沈农豆20的DNA损伤程度显著高于辽豆10号，说明沈农豆20幼苗根尖DNA损伤可能会有级联反应，说明Cd胁迫下诱导辽豆10号和沈农豆20细胞周期阻滞存在基因型差异.

3 讨论与结论

镉胁迫对植物有不同的损害，在生理生化方面表现在叶绿素的合成和光合作用、细胞生长，碳、水、营养物质的转换和吸收等方面［11，25］；同时镉还会破坏细胞内营养物质稳定性，比如钙稳态、激活蛋白激酶C、诱导氧化胁迫引起细胞周期阻滞［25-26］.镉还可以造成DNA单、双链断裂、碱基错配、碱基插入/丢失及DNA链内和链间相互交联、序列改变、甲基化损伤等.DNA损害后有2种选择，一种是修复，另外一种是凋亡，前者是细胞周期检查点监测到DNA损伤并被激活，细胞周期停滞，通过运行各种途径修复细胞，以及在修复损伤后细胞周期恢复；后者是损伤太严重无法修复最终走向死亡［27-28］.本试验结果表明，不同的Cd浓度暴露均能引起大豆幼苗根尖DNA的损伤，造成基因组的不稳定性，Cd处理后辽豆10号细胞周期阻滞在G1/S期，而沈农豆20则是阻滞在G2/M期，说明由Cd诱导的细胞周期阻滞在这2个品种之间存在基因型差异，从而对Cd胁迫响应机制存在基因型差异，损伤类型因品种不同而不同.

研究报道指出Cd胁迫引起大豆DNA损伤，诱导细胞周期阻滞发生在G1/S期［20］，而CyclinB1mRNA水平降低使细胞周期阻滞发生在G2/M期.本研究结果表明，辽豆10号在Cd胁迫下细胞周期阻滞发生在G1/S期，而G1/S期检验点在整个细胞周期进程中起着至关重要的作用，因为它是细胞增殖期开始周期，一旦细胞周期事件开始就进入不可逆事件中，无论环境和条件如何改变，细胞都会正常增殖［29］.CAO等［30］采用real-time qRT-PCR分析了细胞周期相关基因的相对表达，与对照组相比，Cd处理组的错配修复基因MLH1、MSH2和MSH6相对表达量显著降低.这和拟南芥试验中基因表达量的结果相似，说明MSH2和MSH6蛋白是Cd诱导DNA损伤的直接传感器.本研究结果显示，DNA损伤修复基因MRE11、KU70和RAD51在0.25 mg·L-1Cd时其表达量整体呈上调趋势，表明MRE11、KU70和RAD51监测到DNA损伤，然后将损伤信号转导，经过复杂的信号通路对Cd胁迫作出响应，使细胞周期阻滞在G1/S期.徐忠伟等［31］研究显示，华蟾毒可引起肝癌细胞DNA双链断裂，感知DNA损伤的蛋白（Mre11，Nbs1和Rad50基因）及负调控因子p53，通过Mre11/Rad50/Nbs1（MRN）复合体将检测到的DNA损伤情况传导给效应蛋白分子ATM激酶，对DNA双链断裂作出应答响应，再将信息传导给p53蛋白，p53激活，延长半衰期，促进p21CIP1表达，p21CIP1与CyclinA/CDK2/PCNA激酶复合体结合，活性被抑制，细胞周期阻滞在S期［32-33］.

G2/M期和M期转换点，只是延长或缩短细胞周期事件的时间.本研究结果表明，Cd胁迫下沈农豆20的细胞周期阻滞的时期发生在G2/M期，而辽豆10号是阻滞在G1/S期，由此推测沈农豆20细胞内可能存在跨损伤复制机制，沈农豆20的DNA错配修复基因MLH1、MSH2和MSH6的表达量均下调，Cd胁迫拟南芥幼苗根尖细胞周期阻滞试验［30］证实了基因MSH2和MSH6是拟南芥DNA损伤直接传感器，并且介导G2/M期阻滞，与G2/M期相关的标志性基因CYCB1；1的表达量显著下调，基因WEE1的表达量呈典型倒U型，与本试验结果一致.禹黎［34］关于水稻中籽粒Cd积累的QTL定位研究表明，水稻高、低镉QTL分别与耐镉QTL和镉敏感QTL对应，低积累的水稻品种对镉更加敏感.本研究结果表明，MMR系统的组成部分中MSH2和MSH6蛋白参与了大豆幼苗根尖Cd胁迫诱导的G2期阻滞，可以作为Cd诱导DNA损伤的直接传感器.同时MSH2和MSH6基因可以作为选育Cd耐性大豆品种的指示标志物.大豆对Cd胁迫响应机制存在基因型差异，这与李沛然等［35］研究大豆对Cd的吸收和转运存在基因型差异结果相符.通过这种差异可以快速鉴定出大豆品种间的Cd敏感性，且简单易操作，辅助分子育种，为大豆新品种选育提供理论基础，为在中、轻度镉污染的区域从事安全食品生产合理选择品种提供参考依据，同时，也为后续敏感低积累品种选育及生理、表观研究等提供可靠的理论基础.