组织蛋白酶 B在鼻咽癌患者组织和血清中的表达及临床意义

谭媛，王晶，贾群英，刘蓉，唐发清

(湖南省肿瘤医院 肿瘤靶向基因湖南省重点实验室 临床检验中心，湖南 长沙 410013)

鼻咽癌是我国南方及东南亚地区一种常见的头颈恶性肿瘤，其起源于鼻咽部上皮细胞。我国华南地区广东、广西和湖南发病率极高[1]。研究表明，鼻咽癌的发病不仅与EBV病毒(Epstein-Barr virus，EBV)感染、化学致癌物和环境暴露有关，而且与基因的遗传性突变密切相关[1]。流行病学调查显示，鼻咽癌发病具有显著的种族差异、遗传易感性及家族聚集性[2]。远处转移和高度侵袭是鼻咽癌较为显著的临床特征，也是导致患者治疗疗效不佳、生存率降低的重要因素[3]。

组织蛋白酶(Capthesins)是一类溶酶体半胱氨酸组织蛋白酶，包括11个家族成员(Cathepsin B、C、F等)，这些溶酶体组织蛋白酶可消化清除胞内异物，在维持细胞内环境稳定方面发挥重要功能[4]。Capthesin B是Capthesins家族的重要成员，在溶酶体级联反应中发挥关键作用。Capthesin B以主转录本、缺少外显子2主转录本及缺少外显子2和3主转录本等3个形式存在[5]。研究发现，Capthesin B位于癌基因突变的肿瘤细胞表面，例如MCF10AneoT乳腺癌上皮细胞[6]、B16黑素瘤细胞[7]、HCT 116结肠癌细胞[8]。Capthesin B与肿瘤细胞表面膜联蛋白II异四聚体的轻链结合，定位于肿瘤细胞膜的微泡中[9]，肿瘤细胞可通过膜泡、微泡或脱落外泌体分泌活性Capthesin B[10]。

临床研究发现Capthesin B在多种癌症中过表达，如乳腺癌[11]、结直肠癌[8]、前列腺癌[12]、口腔癌[13]、脑癌[14]、肝癌[15]、鼻咽癌[16]和肺癌[17]。Capthesin B通过调节细胞分化、肿瘤细胞生长、自噬、凋亡、迁移、侵袭、血管生成、细胞外基质(ECM)重构及肿瘤免疫反应，参与癌症的发生发展[18]。Capthesin B过表达与鼻咽癌的侵袭和转移有关[19]。为探讨Capthesin B是否可以作为鼻咽癌治疗预后的评估指标，本研究检测了鼻咽癌患者和健康体检者血清标本的Capthesin B浓度，同时还检测了鼻咽癌组织和癌旁正常组织标本Capthesin B表达，结合临床资料分析Capthesin B与鼻咽癌发生发展、治疗预后的关系。

1 材料与方法

1.1 试剂和抗体

Capthesin B抗体(12216-1-AP)购自武汉三鹰生物技术有限公司，Capthesin B 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(CSTB，CSB-E13450h)购自武汉华美生物工程有限公司，免疫组织化学染色(IHC)试剂盒SP Rabbit & Mouse HRP Kit(CW2069)购自北京康为世纪生物科技有限公司。

1.2 鼻咽癌患者血清及组织标本

收集长沙金域医学检验中心2019年8月—2020年2月50例鼻咽癌原发及癌旁正常组织标本，所有患者均经病理学确诊为鼻咽癌，其中男33例，女17例；年龄29～76岁，中位年龄为43.5岁；低分化鳞癌27例，中分化鳞癌19例，高分化鳞癌4例；颈淋巴结转移7例。收集湖南省肿瘤医院检验科2019年7月—2020年3月106例病理学确诊为鼻咽癌患者治疗前、治疗后的血清标本及临床资料，包括年龄、性别、EBVCA-IgG、EBVEA-IgA和TNM分期等。106例鼻咽癌患者中男83例，女23例；年龄27～78岁，平均年龄(50.8 ± 12.1)岁；平均治疗时间1.00(0.70, 3.00)个月；低分化鳞癌96例，中分化鳞癌8例，高分化鳞癌2例；颈淋巴结转移16例。同期收集40例健康体检者的血清标本及临床资料，其中男22例，女18例；年龄25～68岁，中位年龄为42岁。本研究经湖南省肿瘤医院伦理委员会评审通过。

1.3 Capthesin B IHC分析

根据试剂盒的操作说明书进行Capthesin B IHC分析。鼻咽癌组织切片脱蜡至水；抗原热修复；内源性酶灭活；加一抗(Ab-cathepsin B)孵育；加二抗孵育；DAB显色；苏木素复染；PBS返蓝；中性树胶封片、显微镜观察。细胞核/细胞质染色呈黄色或棕黄色(颜色深时为棕色)，认为靶蛋白呈阳性，阳性程度用光密度平均值表示[光密度平均值=累积光密度(IOD)/视野面积(Area)]。

1.4 鼻咽癌组织苏木精伊红染色(HE)

按常规组织染色进行鼻咽癌组织HE染色。即组织切片脱蜡至水，苏木素染液染色，PBS返蓝，伊红染复染，乙醇(95%～100%)脱水，二甲苯浸泡，2次，中性树胶封片，显微镜观察。

1.5 ELISA

ELISA方法检测鼻咽癌血清Capthesin B，具体操作按ELISA试剂盒操作说明进行。将标准品倍比稀释，每孔分别加标准品或待测样本，37℃温育30 min，洗板后每孔加辣根过氧化物酶标记物工作液100 μL，37℃温育30 min；洗板后加底物溶液90 μL，37℃避光显色20 min；加终止液终止反应；用酶标仪在450 m波长依序测量各孔的光密度(OD值)。根据标准品的浓度与OD值计算标准曲线，计算样本浓度，颜色深度与样品浓度成正比。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 人鼻咽癌组织中Capthesin B表达

IHC结果显示，鼻咽癌组织中Capthesin B阳性率明显高于癌旁正常组织(P<0.001)。TNM分期为III、IV期、中低分化、有颈淋巴结转移鼻咽癌组织中Capthesin B阳性率明显高于TNM分期为I、II期、高分化、无颈淋巴结转移者(P<0.05)，不同性别、年龄鼻咽癌组织中Capthesin B阳性率比较无统计学差异(P>0.05)，见图1、表1。

图1 鼻咽癌组织Capthesin B表达检测 1a：IHC检测鼻咽癌组织及癌旁正常组织Capthesin B表达 (IHC ×400)； 1b：鼻咽癌组织及癌旁正常组织Capthesin B表达定量分析(***P<0.001) 图2 ELISA实验检测鼻咽癌患者治疗前后及健康体检组的血清Capthesin B浓度柱状图(*P<0.05；***P< 0.001；nsP>0.05)

表1 鼻咽癌患者组织Capthesin B 阳性率与临床特征的相关性分析 [Q2(Q1,Q3)]

2.2 鼻咽癌患者血清Capthesin B检测

ELISA检测106例鼻咽癌患者治疗前后及健康体检者血清Capthesin B浓度。结果显示，鼻咽癌患者治疗前血清Capthesin B浓度明显高于健康体检组(P<0.05)，治疗1.00(0.70, 3.00)个月后血清Capthesin B浓度显著降低(P<0.001)，治疗后鼻咽癌患者组和健康体检组之间无显著差异(P>0.05)，见表2、图2。

表2 健康体检组与鼻咽癌患者治疗前后血清Capthesin B对比分析 [ng/mL，Q2(Q1,Q3)]

2.3 鼻咽癌患者血清中 Capthesin B与鼻咽癌患者临床特征的关系

表3总结了鼻咽癌患者的临床病理特征，包括年龄、性别、EBVCA-IgG、EBVEA-IgA和TNM分期[20]，结果表明血清Capthesin B浓度与年龄、性别无显著相关性(P>0.05)。TNM分期III、IV期及有颈淋巴结转移、中低分化鼻咽癌患者血清Capthesin B浓度显著高于I、II期、无颈淋巴结转移、高分化者(P<0.05)。EBVCA-IgG、EBVEA-IgA阳性患者的血清Capthesin B浓度显著低于阴性者(P<0.05)。

表3 鼻咽癌患者血清Capthesin B 浓度与临床指标的相关性分析 [ng/mL，Q2(Q1,Q3)]

2.4 血清预测

基于鼻咽癌患者治疗前后血清Capthesin B水平，ROC曲线下面积(AUC)为0.670(P<0.001)，血清Capthesin B浓度临界值为0.437 ng/mL，敏感性为90.6%，特异性为32.1%，提示血清Capthesin B可作为鼻咽癌患者治疗预后的参考指标，见图3。

图3 ROC曲线分析

3 讨论

尽管鼻咽癌治疗效果有了极大的改善，5年生存率甚至10年生存率有了显著提高，但临床上大部分鼻咽癌初诊患者发现时已处晚期，伴多处转移，治疗效果往往不佳。故本研究试图寻找敏感、特异的生物标志物进行鼻咽癌转移预测及疗效评估。

Capthesin B在多种人类癌症中高表达，是癌细胞分泌的一个重要物质[21-22]，血清Capthesin B浓度的变化不仅可用于预测肿瘤进展和预后，还可用于评价治疗效果。Capthesin B作为一种新型血清蛋白生物标志物，在多种恶性肿瘤中被证实其与肿瘤侵袭转移有关[23-25]。同上述研究相同，本研究发现鼻咽癌颈淋巴结转移组Capthesin B水平明显高于无转移组，这充分提示Capthesin B与鼻咽癌转移密切相关，Capthesin B可望成为鼻咽癌转移的预测指标。本研究中鼻咽癌患者原发组织中高表达的Capthesin B提示Capthesin B与鼻咽癌发生发展密切相关。前期研究表明Capthesin B可通过启动细胞保护性自噬发挥抗癌作用[26-27]。本实验结果显示EBVCA-IgG、EBVEA-IgA阳性患者的血清Capthesin B浓度更低，EBVCA-IgG、EBVEA-IgA阴性患者的血清Capthesin B浓度更高，可能与Capthesin B启动细胞保护性自噬，进而抑制EBV病毒活动有关[26]。研究表明，血清高浓度Capthesin B可显著降低癌症患者5年生存率，目前越来越多的研究表明血清标志物浓度的变化可有效反映疾病活动性，进而评估疗效[23]。本研究检测了鼻咽癌患者治疗前和治疗后的血清Capthesin B浓度，结果表明，鼻咽癌患者血清Capthesin B浓度与健康体检组相比有所升高，而治疗后患者血清Capthesin B浓度显著下降，临床分析表明，血清Capthesin B浓度与鼻咽癌TNM分期及分化程度密切相关，提示有血清Capthesin B浓度可作为鼻咽癌治疗预后的参考指标。综上所述，鼻咽癌患者Capthesin B高表达，有效治疗后患者血清Capthesin B显著降低，鼻咽癌颈淋巴结转移患者Capthesin B高于无转移组，提示Capthesin B参与鼻咽癌发生发展，可作为鼻咽癌治疗预后的参考指标。