鼻咽癌肿瘤相关成纤维细胞的实验分析

杨明，范小琴，鄢敏，韩灵，郑朝攀

(1.深圳市人民医院 暨南大学第二临床医学院，南方科技大学第一附属医院 耳鼻咽喉科，广东 深圳 518020； 2.深圳市纳米酶肿瘤转化医学重点实验室 深圳市转化医学研究院 深圳市第二人民医院/深圳大学第一附属医院 耳鼻咽喉科，广东 深圳 518035)

肿瘤微环境 (tumor microenviroment, TME) 在恶性肿瘤发生发展中具有重要的调控作用，肿瘤相关成纤维细胞 (cancer associated fibroblasts, CAFs)作为TME中数量最丰富的一类细胞，是TME的重要组成成分，并通过与肿瘤细胞相互作用，促进肿瘤发生发展和转移，成为近年靶向TME治疗的研究热点[1-3]。在TME中CAFs通过分泌多种细胞因子(cytokine)、趋化因子(chemokine)和炎性因子(inflammatory cytokines) 等激活肿瘤细胞内多条信号通路，从而促进肿瘤细胞的生长、侵袭、转移和血管生成[4-5]。然而，大量研究显示在TME中不同肿瘤类型或不同肿瘤来源的CAFs细胞存在高度的异质性，导致CAFs的类型和生物学作用存在很大差异[6]。因此分离、培养和鉴定不同类型TME中的CAFs成为目前TME研究的前沿问题[7]。目前，针对TME中CAFs的研究较少[8]。本研究通过鼻咽癌和鼻咽炎新鲜组织3D 培养的新方法，分离、培养和鉴定CAFs，为研究CAFs在鼻咽癌发生发展和转移中生物学作用等基础研究提供了前期基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂耗材 I型胶原酶(Sigma 公司 #SCR103)，胰蛋白酶(Sigma 公司 #T1426)，PBS(Hyclone 公司 #SH30256)，胎牛血清(Sigma 公司 #F8687)，DMEM (Gibco 公司#C11995065)，RPMI-1640 (Gibco 公司 #C11875500BT), CAFs标志物检测试剂盒 (CST公司 #31549)， ECL化学发光试剂盒(Protein technology 公司 #PK10002)，Matrigel (Corning公司 #356234)，青链霉素 (Hyclone公司 #SV30010)，BCA蛋白定量试剂盒 (Protein technology公司 #23225)，RIPA细胞裂解液 (碧云天公司 # P0013B)，DMSO (Sigma公司 #D8779)，蛋白酶抑制剂(Roche公司# 4693116001)，磷酸酶抑制剂(Roche 公司 # 4906837001)。

1.1.2 组织样本 收集深圳市人民医院2020年1—6月临床病理鉴定的新鲜鼻咽癌组织和鼻咽炎组织各3例。新鲜组织经鼻内镜取下后立即置于含有50 % RPMI-1640，40 % FBS，10 % DMSO组织保存液中，30 min内送到实验室。所有纳入研究的临床患者均告知并同意签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 成纤维细胞的分离和培养 新鲜组织用含有100 μg/mL 青链霉素的PBS洗2次，然后用眼科剪子剪碎。加5 mL I型胶原酶混匀，37℃条件下孵育1h，300 rpm, 离心5 min，弃上清。加入2 mL，0.25%的胰酶，37℃条件下孵育10 min，加等体积20% FBS的DMEM培养基终止，300 rpm, 离心5 min，弃上清。再加入2 mL 20% FBS的DMEM培养基重悬，过100目分子筛，收集过滤液体1 200 rpm, 离心5 min，弃上清。

消化后的单细胞悬液用20 μL DMEM培养基重悬后，加入300 μL的Matrigel 混匀，取30 μL混合液在6孔板中种3D球培养，加完后立即倒扣置于37℃培养箱培养10 min。在加入2.5 mL 含10% FBS DMEM完全培养基培养，间隔2 d换1次液。

1.2.2 成纤维细胞传代 正常培养1周后，在3D Matrigel 球周围长出呈长梭状的细胞的成纤维细胞(normal fibroblasts,NFs)，取出培养皿，用枪轻轻将Matrigel的球吹落弃掉，培养皿里贴壁生长的细胞为我们需要的成纤维细胞。用胰酶消化重新铺板，培养，稳定传代5代后，收集细胞用于后续鉴定。

1.2.3 免疫荧光实验检测CAFs的标准物的表达 将稳定传代5代的CAFs，将细胞正常消化后，铺于细胞爬片上，48 h后收集细胞，用4% PFA室温固定半小时，PBS洗2次，0.2% Triton X-100的PBS透化10 min，含10%山羊血清的PBS封闭1 h，2%山羊血清的PBS配制的一抗4℃孵育过夜，PBS洗两次，相应荧光二抗室温避光孵育1 h，PBS洗2次，DIPA室温避光孵育10 min，PBS洗2次，封片、成像、拍照。

1.2.4 Western blot实验检测CAFs标准物的表达 将稳定传代5代的CAFs总蛋白用RIPA(加入1X蛋白酶抑制剂和1X磷酸酶抑制剂) 裂解液裂解提取。总蛋白浓度用BCA蛋白定量法提取。总蛋白10 μg用10 %的SDS-PAGE跑胶分离后，转膜、封闭、一抗[波形蛋白(Vimentin)，血管平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscleactin,a-SMA)和甘油醛磷酸脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydro genase,GAPDH)的稀释浓度按1∶1 000)孵育过夜、二抗(山羊抗兔，山羊抗鼠的稀释浓度按1∶2 000)、ECL显影。

1.2.5 细胞增殖CCK8实验 收集成功传代5代的成纤维细胞，调整细胞悬液浓度为1×106个/mL，按每孔2 000个接种于96孔板中，每组做3个副孔，分别在24、48、72 h，弃培养基，加入含10 μL CCK8试剂的无血清DMEM培养基100 μL，培养箱孵育3 h后，上酶标仪检测OD450 nm的吸收值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 鼻咽癌CAFs胞形态学观察

本研究通过3D培养的方法培养1周后，发现在3D球周围长出呈长梭形、条束状，胞质丰富，胞核位于胞体中央。用枪轻轻吸取培养基吹掉3D球后，再用PBS清洗后，加培养基继续培养置长满6孔板，用胰酶正常消化传代。

正常传代5次后，结果如图1所示NFs生长速度较慢，扁平状，边缘规则，细胞排列按一定方向无重叠生长。而与NFs相比，CAFs生长速度较快，长梭形，胞浆丰富，边缘不规则形成毛刺状突起，细胞间排列不规则。

图1 原代分离成纤维细胞形态 (SP ×40) a:NFs； b:CAFs

2.2 鼻咽癌CAFs标准物免疫荧光鉴定

为了鉴定分离的成纤维细胞纯度，将细胞爬片进行免疫荧光染色，图2所示NFs和CAFs 细胞Vimentin染色都呈强阳性，证实这两种细胞高表达间质标志物Vimentin。而与NFs相比，a-SMA作为CAFs的特异性标志物在CAFs中表达呈强阳性，这一结果证实鼻咽癌肿瘤中CAFs高表达a-SMA。

图2 原代分离成纤维细胞免疫荧光染色 (免疫荧光 ×40) a：NFs; b：CAFs

2.3 鼻咽癌CAFs高表达a-SMA

随后，我们将稳定传代5代后的细胞通过Western blot实验检测CAFs标准物Vimentin，a-SMA在CAFs中的表达情况。实验结果如图3所示，与NFs相比，Vimentin的表达水平基本一致，但a-SMA在CAFs中的表达显著升高，进一步证实鼻咽癌CAFs高表达a-SMA。

图3 Westem blot检测鼻咽炎组织中NFs与鼻咽癌组织中的CAFs表达情况

2.4 鼻咽癌CAFs增殖能力

我们将稳定传代5代后的细胞，消化后铺板，每组重复3个复孔，分别在24、48、72 h后加入CCK8试剂孵育3 h后用酶标仪检测检测在450 nm波长处侧吸收值(OD值)，每组检测结果如表1所示。

表1 CCK8实验检测结果

根据检测结果绘制生长曲线如图4所示，与NFs 相比，CAFs的增殖速度明显加快，增殖能力明显增加。

图4 NFs与CAFs的增殖能力曲线图

3 讨论

研究显示在TEM中CAFs促进肿瘤生长、转移的观点已经被广大研究者认同[9]。由于不同肿瘤来源的CAFs存在高度异质性，其在TEM中的作用和分子机制仍然存在着很多未知的领域，尤其CAFs在肿瘤免疫治疗方面，近年研究证实CAFs是抗肿瘤免疫反应的重要调节因子，因此原代分离、纯化和鉴定不同肿瘤特异的CAFs可为后续研究提供材料依据[10-11]。近年研究报道中尚无鼻咽癌CAFs原代培养、鉴定的报道，本研究参照国内外报道的CAFs原代酶消化分离方法并结合3D培养，成功分离培养并鉴定了高纯度的鼻咽癌CAFs。

近年，研究报道的原代分离CAFs的方法主要是组织块贴壁法和酶消化法。其中组织块贴壁法虽然简单易行，但也存在如周期长、纯度差和效率低等缺点。酶消化法则周期短，重复性好等优点，但由于肿瘤组织经酶消化后是多种细胞的混合体，所以在培养纯度上存在很大问题[12]。本研究将组织经酶消化后，结合Matrigel混合通过3D球培养，利用成纤维细胞贴壁生长的特性，在培养过程中简单快速将成纤维细胞与其他细胞分离，且能保证细胞活性。

原代细胞体外培养，最重要的就是保持细胞的生物学特性，我们通过此法可以得到高纯度的成纤维细胞，且经过多次传代后再通过形态学观察、细胞免疫荧光染色，Q-PCR和Western blot技术等对成纤维细胞的特异蛋白标志物进行检测，对分离的成纤维细胞进行了定性研究。结果发现，鼻咽癌CAFs与NFs相比，在细胞形态，蛋白标志物和生物学特性等方面存在差异。本研究发现鼻咽癌CAFs细胞较大，梭形，胞浆丰富，边缘不规则形成毛刺状突起，细胞间排列不规则；特异蛋白标志物Vimentin，a-SMA的表达呈阳性，据此我们对鼻咽癌CAFs进行了鉴定。以上结果与胃癌、肝癌等肿瘤体外分离培养的CAFs与NFs的表型特性相似，证实我们的方法和鉴定结果是可靠可行的[13-14]。

最后，我们对成纤维细胞生物学功能进行了初步鉴定，CCK8检测实验结果发现相对于NFs、CAFs的增殖能力更强，这也证实在鼻咽癌肿瘤微环境中间质细胞CAFs处于激活状态，从而可能在鼻咽癌的发生、发展和转移中发挥了重要作用。

综上所述，本研究成功分离、纯化并鉴定了鼻咽癌CAFs，有望进一步结合临床治疗研究、CAFs基因遗传命运图谱和单细胞测序等先进生物技术手段，阐明CAFs在鼻咽癌发病机制中的生物学作用和抗肿瘤免疫治疗方面提供了新的材料研究基础。