深低温停循环后大鼠海马线粒体通透性转换孔开闭情况研究

帅永孝， 刘 嘉， 张力引

脑组织是人体代谢率最高的器官之一，其对血液供应的依赖非常强，对缺血缺氧也是非常敏感，在常温条件下脑组织血流完全中断数秒就会出现意识障碍，完全中断5～8 min就会产生不可逆的脑损伤[1]。低温的医学应用已有百余年的历史，低温的脑保护作用也得到了广泛的认可,但低温脑保护的作用机制尚未完全阐明。研究[2]表明随着温度的降低，脑保护作用也越明显。不同神经细胞对缺血缺氧的敏感性存在差异，海马区的神经元高度集中，对缺血缺氧性刺激非常敏感，因此本研究选择海马组织作为我们缺血缺氧研究的目标组织。线粒体是真核细胞中重要的细胞器，线粒体的功能障碍在脑缺血后神经损伤中起着关键作用[3]。研究[4]表明，低温脑保护作用的关键是通过线粒体实现的，线粒体的功能障碍与线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,MPTP)密切相关。本研究选取海马线粒体MPTP作为研究对象探讨在不同温度条件下缺血缺氧相同的时间时各实验组MPTP的开放状态的差异，从MPTP的角度阐明深低温脑保护的机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 昆明医科大学动物实验中心提供健康成年清洁级SD大鼠33只，雌16只，雄17只，3只作为体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)供血动物,30只按随机数字表法随机分为正常对照组、常温停循环组和深低温停循环组，每组10只。

1.2主要仪器与试剂 蠕动泵(江苏常州普瑞流体技术有限公司，BL-100型)，大鼠膜式氧合器(东莞科威医疗器械有限公司)，简便式心电监护仪、动物肛温表、全自动变温水箱(昆明医科大学动物实验中心)，各类手术器械(昆明医科大学第二附属医院神经外科)，透射电镜(日本JEOL公司JEM-100CX)、细胞色素C(cytochrome C,CytC)一抗(美国Millipore公司)。

1.3实验方法

1.3.1 CPB的建立 CPB沿用上海交通大学附属仁济医院神经外科田鑫等[5]建立的大鼠深低温CPB模型。在建立CPB前、中、后都进行监测，记录实验过程中大鼠的生理指标。正常对照组：CPB建立成功后，使大鼠肛温维持在36.8～37.0 ℃，不进行降温和停循环，在正常体温水平下进行CPB 20 min。常温停循环组：在36.8～37.0 ℃进行CPB 10 min，停循环10 min。深低温停循环组：在≤27 ℃，CPB 10 min，维持在深低温水平停循环10 min。

1.3.2 海马组织提取与保存 CPB结束后,迅速用断头取脑法提取大鼠双侧海马组织，作好标记放入液氮罐中固定(-178 ℃)。

1.3.3 线粒体验证与分析 各实验组CPB全部结束后，分别提取各组海马组织线粒体。选取提纯的线粒体约0.1 g，送电镜室进行检测鉴定。另取适量线粒体用RIPA裂解液裂解，提取线粒体蛋白，用免疫印迹(Western blot)法以β-actin作为内参蛋白测定海马线粒体内CytC，结果通过Image Lab软件分析灰度值。CytC含量越少，MPTP开放越多。

2 结果

2.1线粒体电镜验证结果 提纯后的线粒体用电镜进行验证提示线粒体纯度非常高，非线粒体成分很少。正常对照组线粒体超微结构正常，呈椭圆形，大小正常，电子密度一致，线粒体膜和嵴清晰可见；深低温停循环组线粒体出现轻微肿胀，部分嵴断裂，膜结构较为完整，少数线粒体呈空泡改变；常温停循环组线粒体数目减少，明显肿胀，大量的嵴扭曲变形断裂，内外膜可见到破损，少数线粒体的基质中出现致密、边界不清的絮状物。见图1。

图1 各组大鼠线粒体电镜扫描图(铅铀染色，×30 000)

2.2Western blot法检测各组大鼠线粒体CytC 正常对照组CytC灰度值较深低温停循环组和常温停循环组高，深低温停循环组CytC灰度值较常温停循环组高，各组间灰度值差异明显。见图2。

图2 Western blot检测各组大鼠线粒体CytC结果图

2.3各组大鼠线粒体内CytC检测结果灰度值比比较 各组灰度值比(灰度值比=CytC灰度值/β-actin灰度值)比较差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组、深低温停循环组、常温停循环组之间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。提示常温停循环组的MPTP较正常对照组、深低温停循环组的开放明显增加(P<0.05)；正常对照组的MPTP开放较深低温停循环组的开放少(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠线粒体内CytC检测结果灰度值比比较

3 讨论

3.1脑是人类最重要的器官，常温条件下人脑能耐受的缺血缺氧时间为5～8 min，超过耐受极限时间将引起不可逆的神经功能损害。脑部温度的降低将降低脑组织的代谢率，提高脑对缺血缺氧的耐受性,脑温下降1 ℃，代谢率下降6%～7%[6]。低温通过抑制细胞内需氧酶的活性，降低组织代谢，减少组织耗氧；抑制脑缺血诱导的兴奋性毒性作用，减少自由基产生和过氧化物的合成，对维持血脑屏障和细胞膜的稳定，起到良好的脑保护作用[7，8]。大量动物实验及临床研究[9,10]均证实深低温能减轻脑损伤后的病理损害程度,促进神经功能恢复,其保护作用的机制研究也由生化、代谢水平深入至分子水平,学者开始尝试从分子水平阐述深低温脑保护的作用机制。

3.2线粒体是真核细胞重要的细胞器，有细胞的“能量工厂”之称，线粒体在脑缺血缺氧后神经元损伤中起关键作用，是缺血缺氧性损伤的主要目标细胞器，线粒体的功能障碍和MPTP有着密切的关系[11,12]。MPTP是位于线粒体膜上由多种蛋白组成的非选择性复合孔道，MPTP功能的发挥是通过其不同的开放状态来实现的[13]。在生理状态下MPTP呈可逆性的间断开放，这便于Ca2+从线粒体基质中释放，从而维持胞浆Ca2+的平衡。MPTP处于关闭状态是维持线粒体内膜低通透性、合成三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的必要条件。在缺血、缺氧状态下，MPTP高水平开放将直接导致线粒体质子电化学梯度耗散、离子稳态打破、细胞质中分子量<1.5 KD的物质都可以通过内膜进入线粒体基质，而基质中合成ATP底物流失到胞质，致使线粒体基质肿胀，膜电位崩溃，呼吸链解耦联，ATP合成减少，外膜破裂CytC释放，最终导致细胞凋亡或者坏死[14,15]。

3.3本研究通过电子显微镜对提取的线粒体纯度进行鉴定并观察各实验组线粒体，结果显示提取的线粒体纯度很高，含少量杂质；线粒体大体结构显示各组间存在明显差异。采用间接法通过检测CytC来间接证明MPTP的开闭情况。在正常情况下CytC存在于线粒体内、外膜之间的腔隙中,MPTP开放时，线粒体发生肿胀外膜破裂，CytC将从线粒体内释放入胞质中，所以MPTP开放的越多，线粒体内含的CytC就越少。可应用原位免疫荧光技术或免疫组化技术检测细胞质或线粒体内CytC含量变化间接反映MPTP开放情况。通过对线粒体内CytC半定量检测证明了缺血缺氧可致使MPTP开放，而深低温可抑制MPTP开放保持线粒体结构和功能的完整，保证了细胞的正常代谢活动从而起到脑保护的作用。