乳腺癌中PBK/TOPK mRNA表达的临床意义及功能预测

李 枫， 李冰滢， 谢 欢， 刘 畅， 张庆梅， 罗 彬， 葛盈盈， 农蔚霞， 陈 芳， 谢小薰

乳腺癌(breast cancer，BRCA)是女性的最常见癌症，也是因癌死亡的主要病因。据统计[1]，2018年BRCA占全球新发癌症病例的11.6%，占癌症死亡病例的6.6%，严重威胁女性的生命健康。虽然近年来BRCA的早期诊断和综合治疗策略有所进步，使BRCA患者的预后得到了极大的改善，5年生存率最高可达98%，但仍有部分BRCA患者存在复发和转移，如三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)，即雌激素受体(estrogen receptor，ER)状态、孕激素受体(progesterone receptor,PR)状态、人表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)状态均为阴性。此类亚型目前仍缺乏有效的治疗靶点，成为临床治疗的一大难题[2，3]。因此，深入研究BRCA的发生、发展机制，有助于为开发BRCA新的治疗靶点提供参考，有重要的临床意义。PDZ结合激酶/T-淋巴因子激活的杀伤细胞来源的蛋白激酶(PDZ-binding kinase/T-LAK cell-originated protein kinase，PBK/TOPK)是癌睾丸抗原(cancer testis antigen,CTA)家族成员之一，其在正常组织中的表达仅局限于睾丸的生殖细胞和胎盘的滋养层细胞，在结肠癌、非小细胞肺癌和胶质瘤等多种恶性肿瘤中高表达，与癌症的恶性生物学行为密切相关[4～7]。但在转录水平分析其在BRCA中表达与临床参数及预后相关性的研究较少，且由于研究方法及样本量可能存在一定差异，部分研究结果的可靠性相对较低。鉴此，本研究通过挖掘公共数据库转录组信息及患者临床资料，分析PBK/TOPK信使核糖核酸(messenger ribonucleic acid，mRNA)在BRCA中的表达情况及其与临床参数及预后相关性，并对PBK/TOPK相似基因进行功能富集分析，预测PBK/TOPK在BRCA中的生物学功能和潜在分子机制，为开发BRCA靶向药物和精准治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1数据资料来源与收集 数据资料主要来自Oncomine数据库和癌症基因组图谱(the Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库，共包含113例正常乳腺组织和659例BRCA组织。TCGA数据库BRCA数据集纳入标准:(1)数据类型为mRNA测序数据;(2)原发性BRCA;(3)性别为女性。排除标准:临床参数有缺失的病例。

1.2PBK/TOPK mRNA在不同肿瘤中的表达分析 应用Oncomine数据库分析PBK/TOPK在不同肿瘤中的转录水平，设置筛选条件为：(1)基因:PBK;(2)分析类型:癌症和正常组织;(3)肿瘤类型:BRCA;(4)数据类型:mRNA。参数设置为默认值,调取PBK/TOPK的mRNA表达数据。

1.3PBK/TOPK mRNA在BRCA和正常乳腺组织中的表达分析 应用University of California Santa Cruz Xena(以下简称UCSC Xena)数据库(https://xena.ucsc.edu/)下载TCGA乳腺癌数据集的mRNA测序数据，分析PBK/TOPK mRNA在BRCA以及正常组织样本中的表达差异情况，利用Graph Pad Prism7.0软件绘制散点图。

1.4PBK/TOPK mRNA表达水平与BRCA临床特征的相关性分析 提取的临床资料包括年龄、ER、PR、HER2、TNBC、组织学类型[包括浸润性导管癌(infiltrating ductal carcinoma，IDC)、浸润性小叶癌(infiltrating lobular carcinoma，ILC)、混合型癌、其他类型癌]、肿瘤-淋巴结-转移(tumor-node-metastasis,TNM)分期、绝经状态。以PBK/TOPK mRNA表达量的中位数值为界将研究对象分为PBK/TOPK高表达组和PBK/TOPK低表达组。

1.5生存分析 基于BRCA mRNA水平的基因芯片数据，应用Kaplan-Meier Plotter数据库(http://kmplot.com/analysis/)进行生存分析，并绘制生存曲线，采用log-rank检验法进行差异显著性检验。根据PBK/TOPK表达水平的中位数将BRCA患者分为高表达组和低表达组，分析PBK/TOPK表达与BRCA患者总生存期(overall survival,OS)和无复发生存期(recurrence-free survival,RFS)的关联性。

1.6功能富集分析 应用基因表达谱交互分析(Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA)数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)检索PBK/TOPK共表达基因，并通过Metascape(http://metascape.org/)对相似基因进行功能富集分析，结果以条形图和网络图展示，高度富集且差异具有统计学意义的结果被认为是PBK/TOPK在BRCA中潜在的生物学功能和相关信号通路。

2 结果

2.1PBK/TOPK mRNA在不同类型肿瘤中的表达情况 应用Oncomine数据库分析PBK/TOPK mRNA在不同肿瘤类型中的表达情况，表达差异有统计学意义的研究结果共有66项，其中表达增高55项，表达降低11项。在BRCA中高表达的研究9项，低表达的研究1项。见图1。

图1 PBK/TOPK mRNA在不同类型肿瘤中的表达情况图

2.2PBK/TOPK mRNA在BRCA与正常乳腺组织中的比较 PBK/TOPK mRNA在BRCA组织中的表达水平显著高于正常乳腺组织(t=28.529,P<0.001)。见图2。

图2 PBK/TOPK mRNA在BRCA和正常乳腺组织中的表达情况图

2.3PBK/TOPK mRNA表达水平与BRCA患者临床特征的关联性分析结果 PBK/TOPK高表达组的ER阴性、PR阴性、TNBC和未绝经的人数比例显著高于PBK/TOPK低表达组(P<0.05)。PBK/TOPK高表达组与PBK/TOPK低表达组在年龄、HER2状态、组织学类型、TNM分期方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.4PBK/TOPK mRNA高表达与乳腺癌不良预后关系 与PBK/TOPK mRNA低表达组相比，高表达组的OS和RFS更短(P<0.05)。进一步分析显示，对于ER阳性BRCA患者，PBK/TOPK mRNA高表达组的OS和RFS更短(P<0.05)；对于PR阳性BRCA患者，PBK/TOPK mRNA高表达组的RFS更短(P<0.05)，但两组OS差异无统计学意义(P>0.05)；对于TNBC患者，PBK/TOPK mRNA低表达组的OS更长(P<0.05)，但两组RFS差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.5PBK/TOPK共表达基因在BRCA中的功能预测和通路富集分析结果 为了解PBK/TOPK在BRCA中参与的信号通路及潜在生物学功能，以相关系数>0.5为标准，共筛选出154个PBK/TOPK相关基因。见表2。应用Metascape进行功能分析，结果表明PBK/TOPK及其相似基因主要涉及BRCA细胞分裂、细胞周期调节和微管细胞骨架形成等生物功能，参与BRCA细胞周期等信号通路(P<0.05)。见图4。

表1 PBK/TOPK mRNA表达水平与BRCA患者临床特征的关联性分析结果[n(%)]

ⓐⓑ所有BRCA患者；ⓒⓓER阳性BRCA患者；ⓔⓕPR阳性BRCA患者；ⓖⓗTNBC患者

表2 154个PBK/TOPK在BRCA中的相似基因

ⓐ功能富集条目，颜色越深表示P值越小；ⓑ功能富集分析网络，不同颜色代表不同富集条目；ⓒ功能富集分析网络，颜色越深表示P值越小

3 讨论

3.1BRCA作为全球女性发病率最高的恶性肿瘤，具有增殖快、易转移和易耐药的特性[8]。目前BRCA的临床治疗取得了一定的进展，已由单一治疗模式逐渐转向精准治疗，相比于手术和化疗，靶向治疗根据肿瘤特异性实现精准治疗，副作用较小，显著提高了患者生存预后。DNA修复通路等多个潜在作用靶点和药物将在BRCA治疗中发挥作用，但作用机制还有待进一步研究[9～11]。

3.2癌睾丸抗原PBK/TOPK最初在海拉细胞cDNA文库中被克隆出，属于有丝分裂原活化蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK)家族成员。越来越多的研究[12，13]表明蛋白激酶在各种类型肿瘤的发生和转移中发挥重要作用。PBK/TOPK可在有丝分裂过程中被磷酸化，参与纺锤体形成，在胞质分裂中也发挥一定作用。此外，PBK/TOPK参与PI3K/AKT信号通路的调控，在肺癌细胞侵袭与迁移中发挥重要作用[14]。有研究[15]表明，在结肠癌细胞中PBK/TOPK通过结合p53基因的DNA结合域，抑制p53的功能，促进肿瘤细胞发生、发展。Simons-Eevlyn等[16]在8种伯基特淋巴瘤细胞系及甲状腺癌等多种恶性肿瘤细胞系中都检测到高水平表达的PBK/TOPK mRNA，在高增殖活性的恶性肿瘤患者的临床标本检测也发现PBK/TOPK mRNA表达增强。Singh等[17]发现PBK/TOPK在膀胱癌组织中的阳性表达率达64.6%。PBK/TOPK在BRCA中高表达,敲除内源性PBK/TOPK可抑制BRCA细胞生长,导致胞质分裂异常,使肿瘤细胞发生凋亡[18]。本研究通过挖掘TCGA等公共数据库进行生物信息学分析，结果表明，PBK/TOPK mRNA在BRCA组织中的表达水平显著高于正常组织，提示其可能与BRCA的恶性增殖密切相关。

3.3近年来，BRCA发病率呈现出逐年上升且偏年轻化的趋势，与老年BRCA患者相比，青年BRCA患者的临床特征更具侵袭性，TNBC的发病率更高，预后较差[19]。本研究结果显示，PBK/TOPK mRNA在年轻患者中的表达水平相对较高，PBK/TOPK mRNA高表达组的TNBC人数比例显著高于低表达组，提示PBK/TOPK可能在年轻TNBC患者的治疗中发挥重要潜能。

3.4细胞周期的失控与肿瘤的发生有关。有研究[20]表明，PBK/TOPK mRNA表达与细胞周期激活的细胞比例有关。在有丝分裂期，PBK/TOPK的表达和磷酸化增强，被周期蛋白依赖性激酶1/细胞周期蛋白B1复合物磷酸化，正向调节PBK/TOPK蛋白与CDK1/cyclin B1的结合，这可能是PBK/TOPK蛋白定位在纺锤体纤维中的重要原因[21，22]。PBK/TOPK还能够磷酸化组蛋白H3的Ser10位点，而组蛋白H3的ser10磷酸化是哺乳动物染色体凝集的开始，是细胞有丝分裂的关键步骤[23]。因此，PBK/TOPK高表达可能通过影响BRCA细胞的细胞周期来促进其增殖。Nandi等[24]发现，异常表达PBK/TOPK的纤维肉瘤细胞，经阿霉素诱导DNA损伤后，PBK/TOPK和p53形成复合物使G2/M检测点减弱，导致中心体复制存在缺陷及不正常的有丝分裂,阿霉素诱导的多倍体细胞瞬时消失而成非整倍体细胞,表现出细胞恶性转化潜能。PBK/TOPK具有促大肠癌细胞恶性转化潜能,阻断大肠癌细胞中的PBK/TOPK表达可使细胞的致癌作用降低[25]。有研究[26]表明PBK/TOPK水平较高的BRCA患者对新辅助化疗反应不佳，预后较差。另外，也有研究[27，28]发现TOPK可以促进肺癌抵抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)激酶抑制剂，抑制PBK/TOPK能够提高胶质瘤对替莫唑胺的敏感性，说明PBK/TOPK与一些治疗抵抗作用相关，可能作为预测治疗效果的标志物。已报道的PBK/TOPK抑制剂，可诱导人肺癌异种移植模型中癌细胞的凋亡，脂质体递送该药物能够使移植瘤完全消退，而小鼠无不良反应[29]，提示PBK/TOPK抑制剂与化疗药物的联合应用可能降低化疗抗性，提高治疗效果。

综上所述，PBK/TOPK mRNA在BRCA中的表达水平显著高于正常组织，与ER状态、PR状态、TNBC和绝经状态相关，PBK/TOPK mRNA高表达可提示BRCA患者预后不良。本研究还通过功能富集分析预测了PBK/TOPK参与功能和信号通路，提示PBK/TOPK可能在BRCA发生、发展中发挥重要作用，这将为后续的实验研究提供理论依据。