机械灌注保存公民逝世后捐献供肝的临床研究进展

黄晓春(综述)，赖彦华(审校)

捐献器官保存虽已过去几十年，但在肝脏保存领域的研究却进展较慢[1]。然而，近年来使用越来越多的扩大标准供体(extended criteria donor,ECD)供肝却使体外机械灌注(machine perfusion，MP)技术重新进入了移植学者们的视野。MP这个概念最早可追溯到20世纪30年代，由Carrel和Lindbergh[2]提出。1968年，Belzer等[3]及Starzl等[4]先后报道了低温MP在人类肝肾保存中的应用。20世纪70～80年代Collins液、UW液(the University of Wisconsin solution)等器官保存液的发明应用，静态冷保存(static cold storage，SCS)随之成为了器官保存的首选方式，取代了当时笨重的MP设备，减轻了对MP需求的迫切性[5]。随着供体器官短缺问题日益突出，扩大供体池的一个策略就是应用ECD[6,7]。这类供体器官术后早期移植物功能不全(early allograft dysfunction，EAD)、原发性无功能(primary nonfunction，PNF)及胆道病变等并发症明显增多[8,9]。传统保存方式已经无法满足器官保存的需要，MP技术再次成为研究热点[10,11]。动物实验[12～15]证实，MP可减轻线粒体的损伤，改善供肝的内皮细胞功能，有效保护胆管及胆管上皮细胞及维持大鼠重度脂肪变性肝脏的形态学结构。根据灌注过程中维持温度不同，MP可划分为低温机械灌注(hypothermic machine perfusion,HMP)、亚常温机械灌注(subnormothermic machine perfusion,SNMP)及常温机械灌注(normothermic machine perfusion，NMP),其对应温度分别为0～10 ℃、20～30 ℃、32～38 ℃[16,17]。但MP同时还受压力、灌注时间、氧合情况等参数综合影响。近年来MP在临床供肝保存中的应用取得了一些令人瞩目的新进展，本文拟对此进行综述。

1 HMP

HMP是目前最为成熟的MP方案，已在肾移植领域广泛应用[10,18,19]。HMP仅用冰块即可实现预期温度，一旦MP设备失常或者人为操作失误，离体器官仍可以在低温下得到妥善保存[11,20]。同时在低温条件下氧耗明显下降，可以不需要携氧载体或其他能量物质，所以在灌注液的选择上空间更大。另外，低温条件下病原体生长缓慢，移植物相关感染亦减少。但这也同时限制了对离体肝脏功能状态的评估，特别是无法评估胆汁的生成状况[16,20]。HMP可单独通过门静脉或双灌注(门静脉和肝动脉)进行。积极的氧合作用在心脏死亡器官捐献(donation after cardic death，DCD)供肝和脂肪肝中都有一定的改善作用，但并不是必需[21～23]。在目前的临床实践中，大多数中心采用双灌注、低温携氧灌注(hypothermic oxygenated perfusion,HOPE)或两者皆有。灌注方法的多样性与低温条件下肝脏代谢需求的减少有关。2010年Guarrera等[23]首次报道了20例标准脑死亡(donation after brain death，DBD)人类供肝使用未携氧低温双灌注的临床研究。结果提示，与SCS组相比，HMP组EAD发生率、谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)平均峰值更低，住院天数亦更少。在随后的5年里，该研究团队进行了一项针对临床肝脏MP保存的经过匹配的队列研究。HMP应用在边缘性DBD器官后，术后胆道并发症发病率HMP组显著低于SCS组(4% vs 13%，P=0.016)[24]。Dutkowski等[21]则首次证实了MP对于DCD供肝的保护作用。在这项研究中，DCD供肝首先经过SCS处理，随后经门静脉进行低温携氧MP，故这项方案也被称为HOPE方案。这项研究证实经过MP保存后DCD供体在肝脏功能、肾脏功能及术后并发症方面都与DBD供体具有可比性。虽然还缺乏进一步大样本的临床随机对照试验，但这项研究对于ECD的应用意义重大。此外，Schlegel教授在2017年国际肝移植学会年会上作会议报告指出，50例接受HOPE的DCD供肝移植后，治疗组5年移植物存活率为94%，未治疗组为78%(P=0.024)，其与标准DBD供肝并无显著差异[25]。这是第一个经HOPE方案治疗的中期生存结果报告，也是目前为止例数最多的临床试验报告。同时，现有3项分别旨在评估HMP与SCS对ECD-DBD、DBD、DCD移植物效果的Ⅱ期或者Ⅲ期多中心临床随机对照试验已经结束，目前尚未见相关结果发表[25]。

2 SNMP

SNMP是一种介于低温与常温之间的灌注方式，环境温度设定为20～30 ℃。与HMP相比，SNMP在保存过程中可以维持组织代谢，因此可以对离体的供肝进行功能评估[14]。与NMP相比，不需要复杂的控温、控氧装置[26,27]。尽管与其他两种灌注方式相比有其独特优势，但目前临床进展较HMP及NMP滞后，关于SNMP的应用报道还局限于动物实验和人类废弃的肝脏中。还需进一步加大研究力度，进行临床试验来评价其功能。Bruinsma等[28]于2014年首次报道了亚常温下(21 ℃)携氧MP在人类供肝中的应用，这也是目前为止SNMP应用于人类供肝的唯一报道。7例人类弃用供肝灌注3 h后，发现随着摄氧量的提升，pH值于开始的20 min内下降，但在2 h后恢复正常，乳酸水平在灌注过程中也恢复正常。丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)水平在20 min内显著增加，之后维持稳定。尿素、白蛋白产生稳定，腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)含量随灌注时间稳定增加，组织学检查显示肝脏内皮细胞无明显损伤。胆汁在生成量及质量方面表现良好。研究结果显示，SNMP能有效地维持甚至改善肝胆功能相关指标。但遗憾的是，该报道中的7例弃用供肝均未应用于移植受体，故无移植后的临床数据来进一步支撑灌注效果。这是未来SNMP临床试验里必不可少的重要一环。控制性携氧复温(controlled oxygenated rewarming，COR)是近年来对MP在温度调控方面提出的一个重要举措。实验结果[29]表明，突然的温度变化(即由低温保存直接过渡到亚低温或者常温)即使在充分氧化的情况下亦容易造成线粒体失功。而COR则可避免热休克损伤，通过缓慢提高代谢活动进而改善移植物功能[30]。Hoyer等[31]于2016年首次报道了COR在临床上的应用，验证了COR在肝脏保存中的可行性及安全性。6例弃用供肝在纯氧状态下接受灌注，由10 ℃开始每隔15 min提升4 ℃直至20 ℃，共用时90 min。6例受体接受此类肝脏移植后均未发生EAD，峰值AST及国际标准化比值均低于同期单纯冷保存对照组，移植物6个月的生存率亦高于对照组(100% vs 80.9%，P=0.24)。该团队目前正在进行一项单中心临床随机对照预试验[25]，进一步扩大样本量，以比较COR与SCS在缺血再灌注损伤方面的效果。该试验已于2019年年底结束，尚未见相关报道。至于复温的最佳温度，目前只有动物实验报道，尚无临床研究。

3 NMP

NMP是一种基于模拟正常体温(37 ℃)状态下进行肝脏灌注保存的方式，旨在提供一种近似生理的环境，以维持正常的肝功能，避免冷缺血性损伤。通过对血流动力学指标、生化参数和合成功能来评估移植物活力[32,33]。目前这项技术在临床尝试应用最为积极。但NMP在技术上具有挑战性，需双重灌注、携氧载体、营养补充及温度控制装置来全面支持肝脏功能。一旦灌注设备失效，器官将有完全暴露于热缺血状态的风险。所以NMP在灌注过程中需密切关注机械运转状况，以及时发现故障并处理[34,35]。目前NMP在临床上已陆续有研究报道。op den Dries等[32]于2013年首次报道经常温灌注后被临床弃用供肝的研究，证实了NMP对DCD肝脏的修复作用及其临床可行性。隶属于欧洲器官保护联盟(the Consortium for Organ Preservation in Europe，COPE)的牛津大学团队于同年在ScienceDaily上报道了首次经NMP后成功肝移植的案例[36]。该中心利用常温灌注了24 h的肝脏进行临床移植，患者术后恢复较好。该实验意义在于提示NMP对延长肝脏保存时限有积极作用。随后该团队于2016年报道了一组临床Ⅰ期试验结果，证明了NMP应用在DBD和DCD移植物的安全性与可行性[37]。与对照组相比，NMP组的供肝AST峰值水平显著降低，且移植后EAD发生率较低，无受体出现缺血性胆管病。该研究还通过血流动力学、代谢和合成功能的检测，证实了NMP的可行性。临床Ⅲ期试验结果证实NMP可显著减少供肝弃用率(50%)并改善移植受者术后肝功能[38]。该临床试验发表的系列结果，包括长期随访数据，或将是确定NMP在肝移植围手术期中临床应用的重要依据。Selzner等[39]和Bral等[40]也相继完成了临床Ⅰ期的NMP试验。这两项研究都初步证实了NMP的安全性和可行性，临床效果与SCS具有可比性。值得注意的是，Bral指出，在一个案例中，由于插管过程中出现了一个操作者未能识别的错误，导致灌注被迫中止，肝脏最终被弃用。该学者由此强调NMP的技术复杂性，并建议NMP操作人员需经过特定的培训，以更为安全有效地使用机械设备。目前还有2个多中心、Ⅲ期随机对照试验以比较NMP和SCS保存移植物效果为目的的临床试验正在进行，均预计于2020年结束[25]。亦有学者在获取后先行SCS一段时间，待移植物转运至受体所在医院后再进行NMP，即终端缺血性常温机械灌注(end-ischemic NMP)[41]。Watson等[42]报道了连续12个被临床弃用的供肝应用end-ischemic NMP的情况，其中灌注前冷缺血时间平均为427 min(222～877 min)。11例患者顺利出院，随访时间平均为12个月，其中3例出现了缺血性胆管病。研究者认为，即使经过NMP灌注治疗，尽量减少冷缺血时间仍是挽救边缘供肝的有效措施；同时应避免高浓度氧气灌注，以减少再灌注后综合征(post-reperfusion syndrome，PRS)和血管痉挛的发生。de Vries等[43]于2019年首次报道了序贯性HOPE-COR-NMP临床方案，尝试将不同温度下MP的优势结合起来。7例临床弃用的DCD来源供肝，经过上述灌注方案处理后，其中5例供肝产生的胆汁pH>7.45。这5例供肝用于人体移植后，在中位(197 d，IQR 152～307 d)随访期内无一例出现缺血性胆道疾病征象。因此研究者团队认为，序贯性HOPE-COR-NMP灌注方案是供肝MP的一种新方法，虽然目前仍需要更长的随访时间观察，但是安全可行的。上述试验仍难以避免一定程度的冷缺血经过。2017年中山大学何晓顺团队报道了全球首例无缺血器官移植(ischemia-free organ transplantation，IFOT)案例[44]。该团队利用NMP技术，在供肝获取、体外保存以及供肝植入过程中持续地为供肝提供血液和氧气机器共运转了270 min，衔接过程中未发生技术性问题。灌注期间的结果提示了NMP的有效性及良好的肝脏评估能力。进一步结果显示，供肝获取前、NMP保存后及复流后肝细胞凋亡没有明显增加。IL-β、TNF-α、IL-6及vWF在灌注全程亦没有明显的阳性表达，提示没有明显的炎症因子释放和肝窦内皮细胞激活。受体于术后第17天顺利康复出院。截至投稿前，该患者仍健康存活，无缺血性胆道病、急性排斥反应等移植肝并发症存在。该案例意义在于，无缺血器官灌注技术的发明应用，有望结束器官移植的冷保存时代。同时有望延伸至所有的实体器官移植中，显著改善移植器官的早期、长期预后，并使边缘性器官得到最大化的利用。

4 结语

随着公民逝世后器官捐献工作的开展，如何评估供肝活性和提高其质量是移植前的两个主要问题。MP为我们提供了一个集诊断、评估预后，甚至包括个性化器官治疗的平台。由此，在移植前我们将由以往单一通过SCS抑制移植物代谢和功能转变为通过MP提供代谢支持和动态评估移植物活性两大类方法并存的局面。对于器官修复来说，一些令人兴奋的方法是将基于MP的基因治疗和间充质干细胞加入到灌注液中[45,46]，以便在移植前修复受损的器官，达成在灌注过程中对移植物进行高度针对性的治疗目的。同时引入生物活性物质和调节免疫反应等干预治疗的临床研究结果亦令人对器官修复的前景充满期待[47,48]。