广西地区患者ABO亚型血清学与分子生物学研究

莫恒诚，李思娜，李 豪，罗瑞献，谢慧琼，黄惠妮，高宏军，黎海澜，莫柱宁

ABO血型是第一个被发现的人类红细胞血型系统，也最具有临床意义，其在输血医学、免疫学、法医学、表观遗传学等方面均具有重要意义。因此，ABO血型的准确鉴定至关重要。ABO血型受人类遗传过程中可能存在的基因突变、病理状态、生理状态等因素影响，常引起机体所表达的血型抗原发生多样性变化，导致部分患者血型表型难以确定，给临床输血带来安全隐患。目前，血型血清学技术鉴定ABO血型是重要的技术之一，但遇到某些因素导致ABO血型正反定型不相符时，血清学技术常难以准确鉴定，此时需要联合基因检测技术才能获得正确的血型结果。ABO亚型是困扰ABO血型正确鉴定的主要因素。ABO亚型是由于基因突变引起酶活性改变，导致红细胞表面A抗原或B抗原结构、性能或数量与正常抗原存在差异，通常具有抗原减弱的特征，即红细胞与抗-A或抗-B血清反应出现凝集强度减弱的现象。不同地区和人群中ABO亚型在血型血清学特点与分子生物学方面也存在差异，导致ABO亚型难以准确鉴定。目前，广西地区对患者ABO亚型的血清学与分子生物学特征方面的研究较少。鉴于此，本文对广西地区患者ABO亚型采用血清学技术、聚合酶链反应-序列特异性引物(polymerase chain reaction-sequence specific primer，PCR-SSP)和聚合酶链反应-测序分型(polymerase chain reaction-sequence based typing，PCR-SBT)技术进行检测，分析其血清学和分子生物学特点，为临床上采用多种方法正确鉴定ABO血型提供理论依据，保障输血安全。

1 对象与方法

1

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1

研究对象 2021年在我院进行ABO血型鉴定的广西地区患者标本(共56 944例无重复标本)中，经血型血清学技术鉴定为ABO亚型的有25例标本，其中男12例，女13例，年龄8～74岁；患者地域分布为南宁12例，河池4例，百色与北海各3例，崇左、钦州、贵港各1例。骨关节疾病、眼部疾病患者各5例，乳腺肿瘤、胃肠道疾病患者各3例，心脏疾病、血液疾病、慢性肾病、甲状腺癌、腹股沟疝、不孕症患者各1例，孕产妇3例。标本为EDTA-K2抗凝静脉血，采集后3 d内进行血型血清学试验。完成血清学试验后留取白膜层-80 ℃低温保存，用于基因组DNA提取。本研究获广西壮族自治区人民医院伦理委员会批准(编号：KY-KJT-2021-49)。

1

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2

试剂与仪器 单克隆抗-A、抗-B血型定型试剂、抗-H试剂和人ABO反定型用红细胞试剂盒(上海血液生物医药有限责任公司，批号20201222、20201126、20215313)；BX-1样本释放液(长春博讯生物技术有限责任公司，批号20210101)，血型血清学专用离心机(日本久保田公司，型号KA2200)；全血基因组DNA纯化试剂盒(杭州博日科技有限公司，批号20200802)，人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒(荧光PCR法，批号20201225)、ABO外显子测序试剂盒(批号20201222)均由江苏中济万泰生物医药有限公司生产；荧光定量PCR扩增仪(杭州博日科技有限公司)，基因测序仪(美国Applied Biosyems公司)。

1

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3

检测方法

1.3.1 血型血清学检测 ABO血型鉴定采用ORTHO VISION Max全自动血型分析仪(Ortho-Clinical Diagnostics公司，英国)、IH-1000全自动血型仪(Bio-Rad公司，美国)检测，检测中发现正反定型不相符(正定型凝集强度<4+，反定型凝集强度<2+)的标本，采用血型血清学试管法进行复核，确认是否为ABO亚型。具体方法包括ABO正反定型试验、吸收放散试验、H抗原检测和抗体筛查试验等，试验严格按第4版《全国临床检验操作规程》进行。根据结果和文献对ABO亚型进行血清学分类。

1.3.2 分子生物学检测 对25例经血清学检测为ABO亚型的样本，同时采用PCR-SSP和PCR-SBT技术进行检测。分子生物学检测均在江苏卫生健康委血型基因检测联合参比(江阴)实验室完成。

1.3.2.1 基因组DNA提取 使用DNA提取试剂盒提取患者全血中DNA，操作过程严格按试剂说明书进行。使用超微分光光度计测定DNA样本浓度，并调整最佳浓度至40～70 ng/μl，调整纯度A260/A280值至1.8左右。

1.3.2.2 PCR-SSP检测 使用人类红细胞ABO血型基因分型试剂盒(荧光PCR法)进行检测，严格按照试剂盒说明书进行操作，检测位点包括

A

、

A

205、

B

和

O

，可用于检测ABO血型系统的

A

、

A

205、

B

、

O

、

O

1、

O

2等位基因。扩增条件：96 ℃ 3 min，1个循环；96 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min，5个循环；96 ℃ 20 s，66 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，10个循环；96 ℃ 20 s，63 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，15个循环；72 ℃ 2 min，1个循环。完成扩增后采集熔解曲线。

1.3.2.3 PCR-SBT检测 使用ABO外显子测序试剂盒进行检测，严格按照试剂盒说明书进行操作。扩增条件：96 ℃ 2 min，1个循环；96 ℃ 20 s，68 ℃ 1 min，5个循环；96 ℃ 20 s，65 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，10个循环；96 ℃ 20 s，62 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，22个循环；72 ℃延伸2 min，1个循环；4 ℃保存。使用2.0%琼脂糖凝胶对产物进行电泳，100 V电泳30 min，根据产物大小判断有无目的片段扩增。用Sanger法对PCR产物进行ABO基因E1-7外显子测序，并使用软件Geneious R9对结果进行分析，对比美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)的红细胞血型抗原基因突变数据库(The Blood Group Antigen Gene Mutation Database,BGMUT)，判断测序结果的基因型及是否存在新的ABO血型基因多态性位点。

2 结果

2

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1

血型血清学检测结果 经血型血清学技术鉴定为ABO亚型共25例，其中A亚型6例，均为A型；B亚型9例，其中以B型为主(5例)，另有B型2例，B型2例；AB亚型10例，其中AB型5例，AB型2例，AB型、AB型、AB型各1例。见表1。

表1 ABO亚型血清学检测与分子生物学检测结果相符的特征

编 号ABO正反定型试验抗-A抗-BAcBcOc自身对照抗-H吸收放散试验AcBc血清学表型分子生物学结果PCR-SSP分型PCR-SBT基因测序1003+0004+/+BelB/BB101/Bw11201+4+1+003+s/+BwB/O2Bw11/O02301+s4+1+004+//BwB/O1Bw11/O01401+4+0003+//BwB/O1Bw11/O01503+mf4+0003+w//B3B/O2Bw11/O01602+4+±003+w//BwB/O1Bw11/O01703+4+1+003+w//BwB/O2Bw11/O0184+001+001+/+ABelA/BA102/Bw1194+1+00001+/+ABwA/BA102/Bw12104+2+mf00001+//AB3A/BA102/B303

注：0为无凝集；1+～4+为凝集强度，其中w为强度以下，s为强度以上，mf为混合凝集；/为未检测，+为通过吸收放散试验可以检出相应抗原

2

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2

分子生物学检测结果 对25例血型血清学检测为ABO亚型的血样均采用PCR-SSP和PCR-SBT技术进行分子生物学检测，结果分别如下：2.2.1 PCR-SSP检测结果 采用PCR-SSP法共检出以下9个ABO基因型：

A/O

1 3例，

A/O

2 3例，

A/OT

1例，

B/O

1 4例，

B/O

2 3例，

B/OT

1例，

B/B

1例，

A/B

8例，

O

2

/O

2 1例。PCR-SSP方法与血清学方法鉴定结果符合率为88.00%(22/25)，但通过该方法仅仅可以检测标本中是否存在

A

、

B

或

O

基因，而无法获知具有哪些ABO亚型基因。结果见表2。2.2.2 PCR-SBT基因测序结果 (1)PCR-SBT共检出ABO亚型10例，其中B亚型7例，AB亚型3例，未检出A亚型。具体基因型分别为

B

101/

Bw

11 1例，

Bw

11/

O

01 5例，

Bw

11/

O

02 1例，

A

102/

Bw

11 1例，

A

102/

Bw

12 1例，

A

102/

B

303 1例。其中，

Bw

11是产生B亚型或AB亚型的主要等位基因(8/10)，其关键核苷酸改变位点为c.695T>C和c.703G>A(见图1ⓐ)。发现另2个导致AB亚型的等位基因

Bw

12(c.278C>T，见图1ⓑ)和

B

303(Intron3+5A>G，见图1ⓒ)。(2)另外15例ABO亚型检测结果均显示为正常的基因型，具体基因型分别为

A

101/

O

02 2例，

A

102/

O

01 5例，

B

101/

O

01 1例，

B

101/O04 1例，

A

101/

B

101 1例，

A

102/

B

101 4例，

O

02/

O

02 1例。其中

A

102是导致本组患者产生血清学亚型的主要等位基因(9/15)。

ⓐBw11等位基因突变位点；ⓑBw12等位基因突变位点；ⓒB303等位基因突变位点

2

.

3

血清学与基因分型结果比较2.3.1 PCR-SSP法与PCR-SBT法结果比较 对于检测ABO亚型中是否含有

A

、

B

或

O

基因，PCR-SBT法检测结果与PCR-SSP法结果完全一致(25/25，100.00%)。然而，PCR-SSP法分型结果较为粗略，无法确定特定的ABO亚型基因，如遇ABO基因特殊突变时，仍需采用PCR-SBT法进一步分析。2.3.2 血型血清学方法与PCR-SBT法结果比较 对于ABO亚型检测，采用血清学与PCR-SBT法检测结果差别较大，共有10例ABO亚型血清学检测结果与PCR-SBT法检测结果一致，相符率仅为40.00%(10/25)，均为含有B亚型的等位基因(

Bw

11、

Bw

12和

B

303)。经PCR-SBT法确认非ABO亚型15例，其中含有

A

102等位基因9例(60.00%)。6例经血清学确定为A亚型的标本中，4例为

A

102/

O

01基因型；而AB亚型亦以

A

102/

B

101为主，为4例。其余血型血清学与分子生物学检测间差异见表2。

表2 ABO亚型血清学检测与分子生物学检测结果存在差异的特征

编 号ABO正反定型试验抗-A抗-BAcBcOc自身对照抗-H吸收放散试验AcBc血清学表型分子生物学结果PCR-SSP分型PCR-SBT基因测序113+mf004+003+//A3A/O1A102/O01123+mf004+003+//A3A/O1A102/O01133+mf004+003+//A3A/O2A102/O01142+mf003+003+//A3A/O2A101/O02152+mf003+s003+//A3A/O2A101/O02163+mf004+003+//A3A/OTA102/O0117004+2+w004+/+BelO2/O2O02/O021803+mf4+w0002+s//B3B/O1B101/O0119±4+1+w0002++/AxBB/OTB101/O04204+000001+w//ABmA/O1A102/O01214+2+00002+//ABwA/BA102/B101224+3+mf0±001+//AB3A/BA102/B101234+3+mf00001+//AB3A/BA102/B101244+3+mf00001+//AB3A/BA102/B101254+3+mf00001+//AB3A/BA101/B101

表下注与表1同

3 讨论

3

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1

ABO血型是临床输血必须鉴定的血型之一，在排除生理因素(如年龄)、病理因素(如冷自身抗体、高免疫球蛋白血症、血液疾病)、试验因素(不规则抗体、试剂等)等干扰后，ABO亚型是影响ABO血型正确鉴定的主要因素。ABO亚型是指在常见的人类4种血型(A、B、AB和O型)之下进一步细分的ABO血型，其共同特点是红细胞表面A和B抗原数量减少或性能改变。目前，ABO亚型鉴定的经典方法是血型血清学技术，该技术主要是根据红细胞与抗-A、抗-B和(或)抗-H等抗血清的凝集反应强度、血浆中抗体、唾液等分泌液中血型物质等血清学特点来进行亚型分型，但由于ABO亚型基因种类远远多于根据血清学划分出的类型，由血清学定义的同一种ABO亚型可以对应多种等位基因，因此该方法只能判断ABO血型的表型。当临床工作中遇到ABO血型难以通过血清学正确鉴定时，常需要借助基因检测技术。

3

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2

本研究对广西地区患者经血清学鉴定为ABO亚型的25例标本，经PCR-SBT技术证实为ABO亚型的仅有10例，血型血清学与分子生物学方法对ABO亚型检测结果一致率较低(10/25)。基因检测发现10例ABO亚型均含B亚型的等位基因(

Bw

11、

Bw

12和

B

303)，其中以

Bw

11等位基因为主(8例)，未检出常见的A亚型等位基因(如

A

205等)。该特点与何保仁等报道的南宁地区献血人群ABO亚型特点相似，与雷航等报道的中国人群较常检出的亚型等位基因不一致，说明本地区人群ABO亚型基因具有地区特异性。

Bw

11亚型在本地区患者与献血人群中均较常见，该等位基因与

B

101等位基因的差异仅在于c.695T>C突变，导致232位氨基酸由亮氨酸转变为脯氨酸、糖基转移酶活性部分丧失而产生B亚型，也说明ABO基因的第232位氨基酸对决定糖基转移酶活性至关重要。

Bw

11基因除了可以导致B抗原减弱以外，还可以使部分患者产生不规则抗-B(5/8)，因此这类患者在临床输血中应选择O型红细胞制剂输注。此外，本研究检出

A

102/

Bw

12和

A

102/

B

303基因型各1例。

A

102/

Bw

12基因型主要在第6外显子发生c.278C>T单点突变，导致第93位的氨基酸由脯氨酸变成亮氨酸，致使B抗原表达减弱，本研究中该表型血清学检测未检出抗-B，与Patnaik等报道的结果一致。而李丽春等报道的

Bw

12导致的B亚型除B抗原减弱以外，还产生不规则抗-B。这表明ABO亚型即使存在共同的基因型，亦可能表现出不同的血清学表型，反之，相同的血清学表型也可对应不同的基因型。而

A

102/

B

303基因型主要发生Intron3+5

A

>

G

点突变，由于该突变引起异常剪接，影响D-半乳糖转移酶的正常表达，导致B抗原数量或性质改变而产生混合视野现象。因此，导致AB或者B亚型的最常见突变基因可能是

B

303基因。

3

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3

另外15例血清学亚型经PCR-SBT法确认为非ABO亚型，在这些不一致的样本中，以

A

102等位基因占比最高(9/15)，与上海地区、南宁地区报道相一致。与

A

101基因相比，

A

102基因翻译糖基转移酶的活力无明显差异，但在本组中9例含

A

102基因的样本有5例血清学均表现为A抗原减弱。

A

102/

O

01和

A

102/

B

101被认为是血清学鉴定与分子生物学确认结果严重不符的基因型，推测可能是由于

A

102与

A

205编码的产物仅存在单个氨基酸的区别(与

A

101相比，

A

102与

A

205均存在c.467C>T基因位点的突变，而

A

205还存在c.1009A>G突变，该位点

A

102与

A

101一致)，在疾病、表观遗传学等因素或某种未知机制影响下，导致A抗原表达减弱，可表现为A亚型相似的血清学反应。此外，本研究仅对ABO基因E1-7外显子DNA进行测序检测，而有文献报道ABO等位基因的启动子、增强子、内含子等非编码调控区域异常亦可导致A或B抗原弱表达，如在ABO基因内含子1转录调控元件+5.8 kb位点发生核苷酸取代，可导致产生弱抗原A和B表型，这也可能是本研究中血清学特征显示为A、B和AB型而分子生物学却提示为正常血型的主要原因之一。此外，本研究有1例样本在血清学技术中通过吸收放散试验分别证实红细胞上存在B抗原，但其基因型为

O

02/

O

02。许先国等通过甲基化分子研究也发现

O

01/

O

02基因型表现为B表型。杜忻等发现1例

O

等位基因表达弱B抗原的个案。另外，本研究有1例样本血清学表型为AB，红细胞上存在A抗原，基因型却为

B

101/

O

04。导致以上2份样本血清学与基因型不符的原因可能为ABO基因各外显子的剪切部位及基因5′端增强子的变异导致抗原表达异常而ABO亚型的整个外显子基因正常。在

A

101等位基因序列的基础上，

O

02和

O

04等位基因第6号外显子第261位碱基的鸟嘌呤均缺失(261delG)，导致提前产生终点密码子，致使翻译过程中产生缺乏酶催化中心的短肽链。章旭和李剑平研究也发现，存在261delG的

O

04等位基因的样本亦有弱A抗原的表达。因此，推测本研究中以上2例样本血清学与分子生物学结果间存在差异可能为261delG缺失型

O

等位基因所导致。

3

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4

本研究分别采用了血型血清学、PCR-SSP和PCR-SBT技术进行ABO血型鉴定，其中血型血清学技术作为ABO血型鉴定的经典方法，目前仍是临床上常用的检测ABO亚型的方法，该方法操作简单、易于在临床上开展，但需要有丰富的血型血清学理论基础与实践经验。血清学技术的正确实施，可以使我们了解患者红细胞表达的ABO抗原强度、是否存在或容易产生不规则抗-A、抗-B或抗-H、是否存在相应血型物质等线索，对其临床意义、遗传特性的判断等也能提供有意义的信息。当血清学技术无法解决ABO亚型难题时，可以采用分子生物学技术进行检测，其中PCR-SSP技术仅仅可以检测标本中是否存在

A

、

B

或

O

基因，而无法获知具有哪些ABO亚型基因。DNA测序技术可以提供精确的核苷酸序列信息，是ABO血型基因检测的金标准，只要检出突变的血型基因，就能准确定型。但分子生物学方法比较费时，即使是较简单的PCR-SSP法，从提取DNA、PCR扩增到电泳或荧光分析整个过程仍需要4 h以上，且对于仪器设备、人员要求较高，不易于在基层医院开展，也不适用于特殊紧急情况下ABO亚型患者的输血救治。

简而言之，科学合理地选择血型血清学和分子生物学技术进行ABO亚型检测，可以大大提高ABO亚型鉴定的准确性，保障临床输血安全、有效。