新改良白膜法制备浓缩血小板的应用效果探讨

熊志高，刘昕晨，杨小罗，王海燕，袁麒辉

血小板输注是治疗血小板减少和出血性疾病的有效手段。随着临床输血技术水平的不断提高，血小板输注用量逐年递增。我国大部分地区血小板的应用主要以单采血小板为主。虽然单采血小板具有纯度高、临床输注效果好、白细胞污染少等优点，但单采献血者招募困难、采集成本高，导致供应不足，难以满足日益增长的临床需求。浓缩血小板(platelet concentrates，PC)通过全血采集分离制备获得，具有成本低、来源广等优点，被中小型血站广泛采用。手工制备PC的影响因素较多，容易导致血小板回收率偏低，甚至可能达不到质量要求，造成血液资源浪费。为保证PC的质量，本站对PC的制备流程在改良白膜法的基础上进一步改良，增加原料全血在离心前的恒温静置步骤，并将此方法命名为“新改良白膜法”，显著提高了PC的质量。现报道如下。

1 材料与方法

1

.

1

血液标本 随机抽选2019年5月至2020年3月株洲市中心血站采集的400 ml规格全血220袋、300 ml规格全血30袋，均符合国家标准。采集时间超过10 min的400 ml全血，以及采集时间超过7 min 30 s的300 ml全血不纳入抽取范围。全血采集的同时留取其同源标本2 ml，(22±2)℃保存。6 h内运送至株洲市中心血站完成PC的制备及血常规检测。

1

.

2

主要设备 大容量离心机(CRYOFUGE 16，德国Thermo公司)、全自动血液成分分离机(Compomat G5，德国Fresenius公司)、血小板恒温保存箱(MDC-10PE，中科都菱)、全自动血细胞计数仪(XS-800i，日本Sysmex公司)、显微镜(CH20，日本Olympus公司)。

1

.

3

主要耗材 PT-Q-400全血六联血袋(山东威高)、PT-Q-300全血六联血袋(山东威高)、一次性使用白细胞过滤输血器材(南京双威)、红细胞稀释液(贝真生物)、白细胞稀释液(贝真生物)。

1

.

4

制备方法 按不同离心方案、不同全血容量、不同制备方法将标本随机分组进行PC制备。除验证条件外，各组均采用相同的离心温度、加速及减速程序。

1.4.1 不同离心方案 将180袋400 ml全血随机分为9组，每组20袋。在传统白膜法离心参数基础上逐步调整相对离心力，采用9种不同的离心方案。见表1。新改良白膜法制备PC：将原料全血于(22±2)℃环境恒温静置1～2 h后进行全血离心16 min，分离出白膜层，再将白膜层于(22±2)℃环境恒温静置2 h以上(但不超过采血后24 h)，进行白膜离心10 min，分离上清制备出PC。

表1 9种离心方案

1.4.2 不同全血容量方案 30袋300 ml全血采用新改良白膜法，离心方式采用方案6制备PC，并与20袋400 ml全血以离心方案6制备PC的实验数据进行对比分析。

1.4.3 不同制备方法 将60袋400 ml全血随机分为3组，每组20袋。分别采用富浆法、改良白膜法和新改良白膜法制备PC。(1)富浆法组：以1 328×g、11 min程序离心，分离出富含血小板血浆三联袋，再以2 988×g、6 min程序离心血浆三联袋，分离去除上清，留取50～76 ml/2 U富含血小板的血浆即为PC。(2)改良白膜法组：采用离心方案6的离心参数，将全血以1 993×g、16 min程序离心分离出富含血小板白膜三联袋，将白膜三联袋置(22±2)℃恒温保存箱静置2 h以上(但不超过采血后24 h)，再以163×g、10 min程序离心，分离上清制备出PC。将两种方法制备PC与新改良白膜法应用离心方案6制备PC的实验数据对比分析。

1

.

5

指标检测 (1)全血血细胞计数：将全血标本充分混匀，用XS-800i全自动血细胞计数仪检测血细胞计数。(2)PC中的血小板计数：将PC充分混匀后留取2 ml标本，取200 μl用生理盐水稀释5倍，再用XS-800i全自动血细胞计数仪检测血小板计数。(3)PC中的红细胞和白细胞混入量：分别用红细胞稀释液和白细胞稀释液对PC进行稀释处理后充入Nageotte白细胞计数板计数池中，于显微镜下计数。

2 结果

2

.

1

不同离心方案制备所得PC的参数比较 在制备前，9种方案血小板水平差异无统计学意义(

P

>0.05)。完成制备后比较结果显示，全血离心方案6所得PC的血小板回收率最高；不同离心方案制备所得PC的红细胞混入量和白细胞混入量差异无统计学意义(

P

>0.05)。见表2。

表2 不同离心方案制备所得PC的参数比较

2

.

2

不同全血容量方案制备所得PC的参数比较在制备前，两组血小板浓度差异无统计学意义(

P

>0.05)。完成制备后比较结果显示，400 ml全血组的PC红细胞混入量显著高于300 ml全血组(

P

<0.05)。白细胞混入量略高于300 ml全血组，但差异无统计学意义(

P

>0.05)。400 ml全血组的PC回收率高于300 ml全血组，差异有统计学意义(

P

<0.05)。见表3。

表3 不同全血容量方案制备所得PC的参数比较

2

.

3

不同制备方法所得PC的参数比较 在制备前，三组血小板水平差异无统计学意义(

P

>0.05)。新改良白膜法制备所得PC的白细胞混入量低于富浆法组和改良白膜法组，且血小板回收率更高，差异均有统计学意义(

P

<0.05)。见表4。

表4 不同制备方法所得PC的参数比较

3 讨论

3

.

1

PC的质量受多种因素影响，包括离心方案、原料全血容量、血液运输、储存条件和温度等。本研究在传统白膜法离心参数的基础上，逐步调整全血及白膜的离心力组合，通过对红细胞和白细胞混入量、血小板计数、血小板回收率等常规指标进行比较，评估PC制备的最佳方案。结果显示，全血以1 993 g离心16 min，白膜以163 g离心10 min的组合为最佳离心方案。该离心方案的全血离心参数与王承琳等报道的最优离心参数相近。本研究在保证白细胞混入量达标情况下尽可能减小白膜离心力，同时，采用自制定型模板装杯离心，以减少白膜离心时血小板的损耗。自制定型模板装杯与王承琳等改进装罐的理念相同。本课题组的前期研究发现，200 ml、300 ml、400 ml三种不同规格的全血制备PC的血小板回收率存在显著差异。本次研究采用新改良白膜法制备PC，以300 ml和400 ml全血为原料制备所得PC的红细胞混入量和血小板回收率也仍然存在显著差异，400 ml全血组的血小板回收率高于300 ml全血组。红细胞混入量虽相对略高，但其本身与全血容量相关，若换算成红细胞混入浓度，二者之间差异则无统计学意义。因此，全血容量也是一个很重要的影响因素。

3

.

2

除此之外，笔者认为，选择合适的制备方法也尤为重要。本研究结果显示，改良白膜法优于富浆法，这与国内相关的报道相符。本研究在单泓等报道的PC制备方法基础上简化离心步骤，优化离心参数，增加全血和白膜的恒温静置流程，此方法显著提高了血小板回收率，同时又降低了白细胞混入量，提升了PC质量。在改良白膜法基础上增加全血的恒温静置，其原理是全血中的血小板在血液运输交接过程中可能发生了可逆性聚集，通过静置一定时间来促进其解聚，有利于血小板的制备回收，与室温过夜的原理相同。本研究结果与刁荣华等研究报道的全血室温过夜制备PC可以明显提高血小板回收率的结论一致，且适宜性更好。因为可以控制在血液采集6 h内完成全血静置和白膜浆袋的分离，从而实现在不影响其他血液成分质量的基础上制备出质量更好的PC。本研究采用新改良白膜法制备所得PC的血小板计数、血小板回收率较陈永婷报道的更高。国外研究也表明，采用全血室温过夜后进行血小板制备比常规方法可以得到更多的血小板，平均高出18.6%～33.0%。但全血过夜可能影响红细胞质量和新鲜冰冻血浆的制备，不符合我国血液贮存要求。

3

.

3

采用全自动血液成分分离机精准制备PC，减少人工操作误差，是提高PC质量的有效措施。本站从2018年3月采用全自动血液成分分离机制备PC，PC质量也得到大幅提升，此方法国内报道较多，在此不再赘述。在实际推广工作中，本站根据研究过程中发现的关键影响因素对用来制备PC的原料全血进行了严格的限定：(1)只将市区采血点采集到的400 ml全血用于制备PC，每隔4 h取一次血，以确保在血液采集6 h内完成全血静置和白膜浆袋的分离。(2)针对其他重要影响因素加强了细节的改进，包括在采血和成分制备部门配置(22±2)℃恒温血液保存箱；使用专用运血车减少血液振荡；配置专用血小板运输箱确保血液运输温度；离心装杯时，将白膜袋用自制塑料模板平整装杯，避免袋体产生褶皱；成分制备工作人员不断提升PC目视检查能力，剔除目视不合格的PC。随着工作的不断优化，血小板质量也得到了提升。

综上所述，新改良白膜法首次采用全血和白膜两次恒温静置制备PC，明显提高了PC的制备质量，值得在对血小板产品制备有高需求的中小血站中推广应用。