支链氨基酸氨基转移酶1在乳腺癌中的表达及意义

郭雄图 袁南贵 罗卫民 闫雪静 胡玉萍*

乳腺癌是女性世界范围内最常见的恶性肿瘤，其中浸润行导管腺癌是最常见的组织学类型。因此国内外许多专家都致力于寻找具有预测浸润性导管腺癌预后效果和治疗作用的生物学标记物。目前雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）和人上皮生长因子受体 2（human epithelial growth factor receptor 2，HER2）是在乳腺癌中应用最为成功的生物学标记物，无论是对乳腺癌患者的预后的预测或作为生物靶点进行靶向治疗［1］。目前已知肿瘤可与宿主机体竞争营养物质，尤其是氨基酸，支链氨基酸转移酶 1（branched-chain amino acid transferase-1，BCAT1）是支链氨基酸分解代谢过程中的关键酶，参与人体生理和病理发生发展的关键过程［2］。目前越来越多的研究发现BCAT1亦参与多种肿瘤的发生发展的过程，如脑胶质瘤［3］、鼻咽癌［4］、肝癌［5］等。然而国内外对BCAT1在乳腺癌中的表达情况鲜有报道。因此为了解BCAT1基因在乳腺癌中的临床意义及预后预测能力，我们通过免疫组织化学的方法，回顾性分析和检测BCAT1与乳腺癌临床病理特点的关系及预后的相关性，分析其作为潜在预后标记物的临床价值。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选取广州市中西医结合医院普外科2009年1月至2010年12月收治的74例接受根治手术的乳腺癌石蜡包埋组织标本，所有患者均未接受术前放疗、化疗、内分泌治疗或免疫治疗等辅助治疗，术后标本均经病理证实为乳腺癌。患者均为女性，年龄介于25～78岁。广州市中西医结合医院伦理委员会同意并批准该实验。同时选取20例相应的癌旁配对乳腺组织作为阴性对照，所取的标本距癌灶边缘至少2 cm，并经苏木精-伊红（HE）染色及病理检查确诊无肿瘤侵犯。

1.2 主要试剂

主要试剂包括：鼠抗人BCAT1多克隆抗体（ab195663，Abcam公司），辣根过氧化物酶标记的兔抗小鼠IgG标记二抗（bs-0296R-HRP，北京博奥森生物技术有限公司），DAB酶底物显色试剂盒（DAB-0031，福州迈新生物技术开发有限公司）、即用型免疫组化超敏UltraSensitiveTM SP试剂盒（KIT-9710，福州迈新生物技术开发有限公司）。

1.3 实验方法及结果判定

1.3.1 实验方法 4μm厚的石蜡包埋组织切片，经常规HE染色确诊为乳腺浸润性导管癌。免疫组化具体流程参照即用型免疫组化超敏Ultra Sensitive TM SP试剂盒说明书的步骤，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶（streptaridin-peroxidase，SP）法。石蜡切片经常规二甲苯脱蜡、蒸馏水冲洗水化后，置入1%H2O2阻断内源性过氧化物酶，磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）漂洗后以10%正常羊血清封闭后甩除后滴加鼠抗人BCAT1抗体（1∶250）后4℃孵育过夜。37℃复温后加入兔抗小鼠IgG标记二抗，之后以DAB显色，并经冲洗、脱水、苏木素复染、脱水透明等操作后以树胶封片。

1.3.2 结果判定标准 BCAT1的免疫组化分析结果判定参考郭雄图［6］的既往文献方法，两位病理医师采用双盲法阅片，每张切片在高倍镜（×400）下随机选取5个视野，结合组织切片中的阳性细胞所占的百分比和阳性细胞染色强度两项指标综合评估。不着色者为0分，淡黄色1分，黄色或棕黄色2分；着色细胞所占百分比计分如下：0%～50%为0分，51%～75%为1分，＞75%为2分。着色强度和着色比例的乘积＜2分为BCAT1阴性，≥2分为BCAT1阳性。

1.4 统计学处理

本次研究的临床和实验数据分析均采用统计学软件SPSS 19.0进行处理。组间计数资料采用卡方检验，计量资料采用t检验。生存分析采用Kaplan-Meier法，组间生存率的比较采用Log-rank检验。多因素分析采用Cox比例回归模型进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BCAT1蛋白的表达

我们通过免疫组化的方法检测74例乳腺癌组织和20例癌旁组织中BCAT1蛋白的表达，结果显示乳腺癌组织中BCAT1的阳性表达率为68.9%（51/74），对照的乳腺癌旁正常组织阳性表达率为35.0%（7/20），差异具有显著的统计学意义（χ2=7.666，P=0.006）。BCAT1在乳腺癌与癌旁正常组织中的表达详见图1。

2.2 BCAT1蛋白的表达与乳腺癌临床病理特征的关系

图1 BCAT1蛋白的免疫组化染色结果（×400）

我们进一步分析BCAT1基因与74例浸润性乳腺癌患者临床病理的关系如表1所述。结果显示BCAT1蛋白的表达与患者的年龄、N分期、组织学分级、雌激素受体和孕激素受体的表达情况无关（P＞0.05）。其中BCAT1高表达组的进展期T分期、TNM分期的比例明显高于BCAT1低表达组，而且BCAT1高表达组的肿瘤直径较大、淋巴结转移的比例较高，两组患者在T分期、肿瘤大小、淋巴结转移和TNM分期方面的分布差异均具有显著的统计学意义（P＜0.05）。

2.3 BCAT1蛋白的表达与乳腺癌患者总体预后的关系

随访截止时间为2016年12月。无1例失访。通过Life-table法计算两组患者的总体生存率，结果显示BCAT1高表达组和低表达组的5年总体生存率分别为56.9%和82.6%。经Log-rank检验分析结果显示BCAT1蛋白高表达组患者的预后明显差于低表达组，两组间差异有统计学意义（χ2=5.209，P=0.022，见图2）。

2 讨论

糖代谢有两种途径：线粒体的氧化磷酸化和糖酵解。然而肿瘤细胞的过快生长往往造成肿瘤细胞的缺氧状态，因此肿瘤细胞的能量供给主要依赖于葡萄糖的糖酵解而并非正常细胞的氧化磷酸化。Warburg效应认为肿瘤细胞的这种能量供给模式使得肿瘤产生大量的乳酸，同时伴随谷氨酸的代谢增加，后者可产能、合成核苷酸、合成其他氨基酸。乳腺癌的发生发展是一个多病因多步骤的复杂过程，代谢异常亦是其中关键的步骤。BCAT1基因又名ECA39基因，含11个外显子，共编码641个氨基酸，其产物BCAT1可催化支链α-酮酸通过转氨基作用转化为L-支链氨基酸，因此BCAT1基因可调控谷氨酸的代谢，并影响为细胞合成ATP提供能量的原材料［7］。目前已知BCAT1在多种恶性肿瘤中均发现异常高表达状态，并调控肿瘤的侵袭转移、增殖、凋亡等多个肿瘤生物学行为。BCAT1通过催化BCAA为肿瘤提供能量、增强肿瘤的化疗耐受性和降低化疗敏感性等多种机制发挥其癌基因的作用，Zhang L［8］的研究揭示BCAT1可激活mTOR信号通路而发挥促使乳腺癌细胞生长和克隆形成，敲除BCAT1可抑制mTOR信号通路介导的线粒体生物发生学和功能。然而BCAT1在乳腺癌中的研究尚处于起步阶段，BCAT1基因在乳腺癌的预后价值尚未见相关报道。本研究通过探讨BCAT1在乳腺癌中的表达及临床意义，期待BCAT1可作为新的乳腺癌诊断标记物和治疗靶点发生作用。

图2 BCAT1蛋白的表达与乳腺癌患者总体预后的关系

目前已知支链氨基酸（branched-chain amino acid，BCAA）参与多种肿瘤的发生发展，如研究显示人体循环中的BCAA水平升高可能是胰腺癌发生的早期伴随事件，动物实验进一步证实Kras突变诱导的胰腺癌伴随外周血中BCAA的水平上升［9］，提示的BCAT1的作用机制可能与Kras基因突变相关。由于BCAT1是BCAA分解代谢的关键酶，是维持正常神经功能的关键因素，其代谢异常常导致神经功能障碍，国外学者 Tönjes［10］发现 BCAT1在野生型IDH的脑胶质瘤中高表达，突变型IDH和正常脑组织中无异常高表达状态，国内学者张国滨［3］亦发现BCAT1的异常高表达存在于不同恶性程度的脑胶质瘤中，并与神经胶质瘤的恶性程度呈正相关，提示BCAT1可能是促使脑胶质瘤病情进展的关键启动因素之一。此外有研究发现在Ⅰ～Ⅳ期结直肠癌外周血中甲基化的BCAT1阳性率分别为24%、62%、68%和81%，因此该学者认为循环中的甲基化BCAT1有具有作为结直肠癌诊断和预后标记物的潜在价值［11］。本研究通过回顾性分析正常乳腺组织与浸润性乳腺癌组织，研究发现浸润性乳腺癌组织中BCAT1的表达水平明显高于正常乳腺组织，提示BCAT1亦可能是乳腺癌发生的关键因素。

国内学者王宏刚［12］通过免疫组织化学的方法检测BCAT1在肝癌中的表达情况，研究发现BCAT1蛋白在肝癌组织中的表达下调，且与临床资料特征无显著的相关性。然而Xu［13］通过荧光定量PCR和免疫蛋白印迹法有相反的结果发现，肝癌细胞株中BCAT1的表达水平明显高于正常L-02的肝细胞株，在人体肝癌中亦有相似的结果发现，肝癌组织中BCAT1的表达水平明显高于正常肝脏组织。进一步的临床分析结果发现BCAT1与肿瘤的TNM分期、肿瘤个数和肿瘤分化密切相关，并可作为预后的生物学标记物预测肝癌患者的5年生存率和无复发生存率。因此BCAT1基因与肿瘤的临床病理特征的关系，目前仍未清楚。本组研究发现尽管BCAT1与患者的年龄、N分期、组织学分级、雌激素受体和孕激素受体的表达情况无关，但BCAT1的高表达水平与T分期、肿瘤直径、淋巴转移和TNM分期呈正相关，而且由于本组研究的入组病例数并不多，统计效能不足可能也是引起N分期无统计学意义的原因之一。

肿瘤大小和淋巴转移是乳腺癌患者的预后标记物。乳腺癌肿瘤越大、淋巴转移均提示肿瘤的恶性程度高、侵袭和迁移能力强，总体预后不佳。与郭雄图在结直肠癌中的结果发现相似，本组研究的结果发现BCAT1的高表达提示总体预后不佳，这可能与BCAT1高表达与肿瘤直径大、淋巴转移呈正相关有关。

近年来，尽管乳腺癌在综合治疗如化疗、放疗、内分泌治疗或免疫治疗取得长足进步，可通过对BCAT1基因与乳腺癌临床相关性的分析，能从局部探讨代谢异常对乳腺癌的作用。然而受限于本组仅为临床回顾性分析，而且样本量局限，并未涉及分子机制研究，但就本研究结果得出的结论而言，BCAT1的异常高表达与乳腺癌的发生发展密切相关，并与恶性程度高、预后不佳呈正相关。

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