8-Nitroguanine在肝吸虫相关性肝内胆管癌中的表达以及意义

林杰，刘清波，何威，马靖，陈韵壕，王卫东

肝内胆管细胞癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是第二位原发性肝脏恶性肿瘤，占原发性肝癌的10%～20%，其发病率和死亡率近年来呈上升趋势［1］。ICC 发生隐匿、早期诊断困难、恶性程度高、发展迅速、等临床特点，临床总体预后较差［2］。外科手术是ICC 目前有效的首选的治疗方法，但手术切除率低，术后易复发，术后5 年总生存率仅为30%左右［3］。ICC 发生主要与肝吸虫感染、肝内胆管结石、硬化性胆管炎以及病毒性肝炎有密切的关系。8-Nitroguanine 是细胞炎症反应中由活性氮族攻击核酸的产物，其在麝猫后睾吸虫（opisthorchis viverrini，OV）感染的动物肝脏中有较强表达［4］，目前被认为是一种潜在炎症相关性癌变标志物［5］。本实验研究 8-Nitroguanine 在伴有华支睾吸虫感染的ICC 患者病理组织以及血清表达的情况，初步探讨8-Nitroguanine 与华支睾吸虫感染相关性ICC 的关系，为进一步阐明ICC 发生发展机制提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 一般资料

组织标本以及血清取自南方医科大学顺德医院肝胆胰脾外科2016 年1 月至2018 年6 月行根治性切除的伴有肝吸虫感染的ICC 患者，包括：①术前有大便肝吸虫卵阳性或影像学证明有肝吸虫感染或术中、术后病理表标本见有肝吸虫虫体（或肝吸虫虫卵）；②术后病理学证实为肝内胆管细胞癌；③排除伴随病毒肝炎感染、肝胆管结石、硬化性胆管炎或先天性肝内胆管扩张症（Caroli 病）的肝内胆管细胞癌患者；④经过医院伦理委员会批准以及患者知情同意。患者总共18 例，其中男性16 例，女性 12 例，年龄 45～65 岁，平均年龄 50 岁。所有患者术前均未接受放、化疗，组织标本均在手术切除后15 min 内采集行新鲜标本置于-80℃冰箱和石蜡片固定保存。

18 例肝内胆管细胞癌血清标本手术前一天采集，另外同时取自知情同意的18 例住院治疗的肝吸虫性胆管炎患者及18 例体检的健康志愿者。血清标本在离心分离后，置于-80℃保存。

1.2 试剂以及主要仪器

8-Nitroguanine 购自 Kamiya 公司；Abcam 抗体购自 Abcam 公司，Qproteome FFPE Tissue 试剂盒购自 QIAGENE 公司，ELISA 试剂盒（STA-825）购自Cell Biolabs 公司；DMSO 购自上海试一化学试剂公司；胎牛血清（PBS）购自 FBS Ausbian 公司；6 孔板、96 孔板购 Corning 公司；M2009PR 型号酶联免疫检测仪购自Tecan infinite 公司。

1.3 石蜡标本的组织总蛋白的提取

取ICC 患者肿瘤组织、癌旁组织和正常肝组织石蜡标本样品放入EP 管中，二甲苯室温浸泡10 min，1000 rpm 2 min 离心去上清，重复一次；无水乙醇室温浸泡10 min，1000 rpm 2 min 离心去上清，重复一次；95%乙醇室温浸泡10 min，1000 rpm 2 min 离心去上清，重复一次；70%乙醇室温浸泡10 min，1000 rpm 2 min 离心去上清，重复一次；将EXB 缓冲液加入β-巯基乙醇，配成工作液；每管加入80 μL EXB 工作液，涡旋振荡，冰上5 min，100 ℃20 min，80 ℃ 2 h，马上放到冰上 1 min，14 000 g 15 min 4℃离心，取上清，用于ELISA检测。

1.4 ELISA 检测 8-Nitroguanine 表达

取肝内胆管细胞癌、肝吸虫性胆管炎及健康志愿者血清50 μL 于96 孔板，向每个孔中加入用PBS 按 1∶400 稀释的 8-Nitroguanine 共轭物孵育 4℃过夜；倒掉液体，用200 μL PBS 洗一次；加入200 μL Assay 稀释液，孵育2 h；制作浓度的标曲，每孔加入样品或标准品50 μL、室温孵育10 min；每孔加入 50 μL 用 Assay 稀释液按 1∶2000 稀释的 Anti-8-Nitroguanine 抗体；用封口膜封住微孔板，摇床上室温孵育1 h；倒掉孔内液体，加入250 μL 1×洗涤缓冲液，30 s 后倒干净液体，重复5 次；每孔加入100 μL 用 Assay 稀释液按 1∶1000 稀释的二抗；用封口膜封住微孔板，摇床上室温孵育1 h；倒掉孔内液体，加入 250 μL 1×洗涤缓冲液，30 s 后倒干净液体，重复 5 次；每孔加入 100 μL 基质溶液，避光孵育 2 ～ 30 min；每孔加入100 μL 终止液；用酶标仪读取450 nm 下的OD 值，根据标准品数值绘制标准曲线，计算血清8-Nitroguanine 含量。

1.5 细胞培养

RBE 细胞按106/孔接种于6 孔板，使用含10%胎牛血清DMEM 高糖培养基，置于含5%CO2，37℃饱和湿度环境中进行培养，取对数生长期的细胞用于细胞功能学实验。

1.6 细胞增殖实验

RBE 细胞按 2000/孔接种于 96 孔板，设置 6 个复孔，实验分为药物组和溶剂组，8-Nitroguanine 溶解于DMEM 培养基，药物组以梯度浓度（0.0、0.1、0.5、1、2、4、8、16、24、32、48、64、128、256 nM）8-Nitroguanine 溶液处理细胞，溶剂组以等量溶剂处理细胞。24 h 后每孔加入20 μL MTT 工作液（5 g/L），继续37℃孵育2 h。弃去上清液，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）200 μL，置平板摇床震荡至结晶完全溶解后，酶标仪测定490 nm 波长各孔的吸光度（OD）值，实验重复3 次，取平均值计算不同浓度的8-Nitroguanine 对细胞增殖抑制率，并根据浓度反应曲线拟合计算半抑制浓度（IC50）。

1.7 细胞侵袭实验

提前以50 μL 10% Matrigel 基质胶包被Transwell 小室，以浓度为 IC50 值的 8-Nitroguanine 溶液处理RBE 细胞24 h 后，无血清培养基重悬细胞，以5×104/孔接种于Transwell 上室，下室加入含10%胎牛血清的培养基，常规培养24 h 后，4%多聚甲醛固定细胞20 min，结晶紫染色着色25 min，取出小室，用棉签轻柔拭去小室内侧膜细胞，显微镜下随机选择5 个视野进行细胞计数，并计算各组细胞的侵袭率。

1.8 统计学方法

数据采用Graphpad Prism 7.0 软件进行统计分析。计量资料的统计学描述以表示，两组计量资料比较采用t检验，多组计量资料的比较采用方差分析检验，两两比较用Dunnett"s 法，检验水准为α=0.05（双侧）。

2 结 果

2.1 8-Nitroguanine 在ICC 患者临床病理标本表达情况

ELISA法检测结果显示，8-Nitroguanine在ICC癌患者肿瘤组织中表达量显著（199.63±35.15）ng/mL，明显高于癌旁组织（43.02±10.43）ng/mL 和正常肝组织（41.10±11.24）ng/mL，差异有统计学意义（P＜0.001）。而后两者中8-Nitroguanine 差异无统计学意义（P=0.9518）。

图1 8-Nitroguanine 在ICC 患者病理组织中表达 ***表示P＜0.001，n.s 表示P＞0.05

2.2 8-Nitroguanine 在肝内胆管细胞癌患者术前血清中表达

ELISA 法检测结果显示（图2），健康正常人、肝吸虫性胆管炎患者以及ICC 患者三者进入血液中 8-Nitroguanine 值分别为（331.17±61.71）ng/mL 和（346.075±85.22）ng/mL 和（325.36±77.79），三种差异无统计学意义（P=0.6994）。

图2 8-Nitroguanine在各种人群血清中表达 n.s表示P＞0.05

2.3 8-Nitroguanine 对胆管癌细胞增殖能力的影响

剂量反应曲线显示（图3），8-Nitroguanine 对RBE 细胞的增殖能力具有抑制作用，该作用呈浓度依赖性，曲线拟合计算得出IC50 值约为128nm。

图3 8-Nitroguanine 对胆管癌细胞RBE 增殖能力的影响

2.4 8-Nitroguanine 对胆管癌细胞侵袭能力的影响

细胞侵袭实验显示（图4），药物组和溶剂组的侵袭细胞数分别为（188±21）个和（179±3）个，两者差异无统计学意义（P=0.70）。说明8-Nitroguanine对胆管癌细胞的侵袭能力无明显作用。

3 讨 论

图4 8-Nitroguanine 对胆管癌细胞RBE 增殖能力的影响 n.s 表示P＞0.05

肝吸虫感染与ICC 关系密切，被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）列为Ⅰ类致癌因子［6］。肝吸虫寄生在肝胆管，其机械性刺激和虫体代谢产物的作用主要造成局部急性或慢性炎症，引起胆管上皮损伤，诱发炎症相关性疾病。肝吸虫诱发肝内胆管癌是一个复杂的慢性、长期过程，但其具体机制不清。肝吸虫主要分为华支睾吸虫（Clonorchis sinensis）和麝猫后睾吸虫（Viisthorchis viverrini），两者分布上略有不同，前者主要分布于中国、韩国和越南的部分区域，而麝猫后睾吸虫主要分布在东南亚国家，如泰国、老挝、越南和柬埔寨。相对而言，目前对麝猫后睾吸虫导致胆管癌的研究更为深入。Pinlaor S 等研究表明了麝猫后睾吸虫（opisthorchis viverrini，OV）诱发肝内胆管癌的机制可能在OV 抗原可能通过Toll 受体介导通道引起炎症反应，导致诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和环氧合酶-2（Cyclooxygenase 2，COX-2）的表达以及核因子kB（nuclear factor-κB，NF-kB）的激活，从而导致胆管上皮细胞癌变［7，8］。而本研究将探究8-Nitroguanine 对华支睾吸虫相关性ICC 的致病作用，进一步阐明华支睾吸虫感染和ICC 的关系。

大约25%癌症病例由慢性炎症引起［9］。慢性炎症反复刺激，炎症细胞和上皮细胞产生活性氧物质（Reactive oxygen species，ROS）和活性氮物质（Reactive nitrogen species，RNS），损伤细胞各种成分，比如核酸、蛋白、脂质等。8-Nitroguanine 是一种致突变DNA 损伤物质，主要在活性氮物质反应中由细胞表达诱导型一氧化氮合酶（iNOS）催化细胞内大量合成一氧化氮（Nitric oxide，NO）导致细胞 DNA 鸟嘌呤硝基化的产物［10］。8-Nitroguanine 具有潜在致突变性，可诱导DNA G：C 突变至T：A，诱发 DNA 损伤并导致癌变［11］。Hiraku Y 等［12］研究发现在OV 感染的急性期，8-Nitroguanine 在炎性细胞内明显增加，而在慢性感染期，这种DNA 损伤出现在胆管上皮细胞内，重复感染增加了8-Nitroguanine在胆管上皮细胞内形成，而用吡喹酮治疗明显减少8-Nitroguanine 生产。该研究组用免疫组化方法发现在OV 感染的肝内胆管细胞癌的临床病理标本中，8-Nitroguanine 在癌组织累积比正常组织明显增强［13］。另外，8-Nitroguanine 这种 DNA 损伤累积在与癌症相关病人体中发现，比如幽门螺杆菌、慢性丙型肝炎、人乳头状瘤病毒、EB 病毒等［5］。

本研究结果发现在伴有华支睾吸虫感染的ICC 癌组织中8-Nitroguanin 的浓度明显高于正常肝组织和癌旁组织，而正常肝组织和癌旁组织中8-Nitroguanin 的浓度无明显差异，提示8-Nitroguanin 可能在华支睾吸虫相关性ICC 的发生发展中发挥重要作用。8-Nitroguanine 的在DNA 以及RNA形成上不稳定，能自动释放，在血液中也能检测到［10］。本研究结果发现在健康正常人、华支睾吸虫性胆管炎患者以及ICC 患者血清中均能检测到8-Nitroguanin，但血清中8-Nitroguanin 的浓度在ICC无明显升高，提示8-Nitroguanin 的致癌作用与其形成局部炎症反应有关，这与Pinlaor S 等研究推测相一致［13］。

DNA 损伤会触发细胞的自我清除机制，导致细胞凋亡或坏死，其带来的大量基因组突变也会抑制细胞的生长［14，15］。本研究细胞功能实验表明，8-Nitroguanin 作为一种DNA 损伤诱导物质，能够显著抑制胆管癌细胞的增殖特性，但细胞侵袭实验显示，8-Nitroguanin 并未对肿瘤细胞的侵袭特性产生任何影响，说明8-Nitroguanin 对ICC的致病作用主要体现在诱导DNA 损伤并触发癌变，而在癌变后肿瘤细胞恶性特征并无维持作用。

综上所示，肝吸虫感染诱导肝内胆管细胞癌发生可能是由于肝吸虫感染后导致肝胆管反复急慢性炎症，炎症不断刺激炎性细胞以及胆管上皮细胞产生8-Nitroguanine，并在局部积累，诱导细胞DNA 突变从而导致肝内胆管细胞癌发生发展，但具体机制还需要进一步深入研究。