胃癌组织中HIF-1α，CD68及CD206在胃癌及癌旁组织中的表达及临床意义

周太成，马宁，黄恩民，马涛，陈嘉林，陈双

越来越多研究表明巨噬细胞（Mφ）是肿瘤微环境中最重要的炎性细胞之一，其表面标记物CD68蛋白的高表达与胃癌病人不良预后显著相关［1］。缺氧是几乎所有人类实体瘤的典型特征，高增殖的肿瘤细胞比脉管系统发育得更快，因而呈缺氧状态［2］。其中，低氧诱导分子-1α（HIF-1α）是HIF-1的活性亚基，也是肿瘤组织缺氧的标志物；而缺氧的微环境引起一系列事件发生，包括血管生成、能量代谢改变、免疫破坏、持续增值信号及侵袭转移等，明显影响肿瘤患者的预后［7］。同时，作为实体肿瘤微环境（TME）中数量最多的免疫细胞，肿瘤相关巨噬细胞（TAM）优先聚集在肿瘤缺氧区，并主要极化成 M2 型巨噬细胞［8］。而 M2 巨噬细胞可通过增强肿瘤血管生成、组织重塑及转移促进肿瘤进展［9］。因此，M2 型巨噬细胞表面标记物CD206 的表达高低也影响肿瘤患者的预后状态。此外，缺氧的肿瘤微环境同时可以招募巨噬细胞，并调节巨噬细胞向 M2 型活化和极化［10，11］。肿瘤干细胞（CSCs）是一种被认为能够促进肿瘤生长和转移的细胞亚群，在乳腺癌、胃癌、胰腺癌、结直肠癌等肿瘤中均被发现并起着重要的作用［12］。缺氧和TAM 均可引起肿瘤细胞的干细胞化，对干细胞的自我更新和维持分化扮演者关键的角色［13-15］。

本研究初步探讨 HIF-1α、CD68、CD206 蛋白表达与胃癌临床病理相关性，对预测胃癌患者预后，进一步加深对胃癌发生发展的认识有重要价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集 2016 年 1 月-2018 年 1 月在中山大学附属第六医院手术切除的胃癌标本，均经术后病理确诊。其中，男 33 例，女10 例；年龄 39～78 岁，平均年龄58.8 岁。所有患者术前均未接受放化疗治疗，取距癌旁3～5 cm 的正常组织作为对照。

1.2 方法

鼠抗人 HIF-1α、CD68、CD206 单克隆抗体均购自广州佳研生物有限公司。参照抗体说明书步骤检测三种蛋白在胃癌及癌旁组织中的表达：恒温及酒精脱蜡；梯度酒精脱水；抗原修复；山羊血清封闭；封闭一抗二抗；DAB 显色；苏木精复染；封片、观察；以PBS 代替一抗作为阴性对照。

1.3 图片观察

免疫组化染色后的切片在正置显微镜200 倍下计数5个视野，最终得分=着色强度得分+阳性细胞百分比得分。按下列进行评分：阳性细胞：5%以下计0 分、～25%计1 分、～50%计2 分、～75%以上计3分、＞75%计4分；着色强度：无着色计0分、浅着色计1分、棕黄色计2分、深棕色计3分；阴性≤2分，阳性≥3分；同时记录每个视野阳性细胞数。

1.4 统计学处理

使用 SPSS 24.0、GraphdPad Prism 8 软件分析数据，计量资料的比较采用独立样本t检验，计数资料的比较采用χ2检验，3 种蛋白表达的关联性采用Spearman 分析，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 三种蛋白在胃癌和癌旁组织中的表达情况

HIF-1α、CD68 均表达于细胞质，CD206 表达于细胞核和细胞质。HIF-1α在胃癌、癌旁中的阳性率分别是58.1%、18.6%（P＜0.05）；CD68 在胃癌、癌旁中的阳性率分别是69.8%、23.3%（P＜0.05）；CD206在胃癌、癌旁中的阳性率分别是51.2%、9.3%，差异均有统计学意义（P＜0.05，图1、表1）。

表1 三种蛋白在胃癌及癌旁组织的表达情况（n）

图1 HIF-1α、CD68、CD206 在胃癌及癌旁组织中的表达（SP,×200） HIF-1α的表达主要在胃癌细胞，CD68、CD206 主要表达在间质细胞

胃癌、癌旁组织中每个视野下CD68+细胞数分别为（39.7±7.6）、（8.5±2.8）个；CD206 阳性细胞数分别为（32.0±9.2）、（3.4±1.8）个；HIF-1α+细胞数（22.9±5.6）、（2.1±1.2）个；以上组间比较差异均有统计学意义（P＜0.01）（图2、图3、图4）。同时，胃癌组织中CD206+细胞数与HIF-1α+细胞数表达呈正相关（P＜0.01，R2=0.641）（图5）。

图2 CD68+细胞在胃癌和癌旁组织中的表达 **P＜0.01

图3 CD206+细胞在胃癌和癌旁组织中的表达 **P＜0.01

图4 HIF-1α+细胞在胃癌和癌旁组织中的表达 **P＜0.01

2.2 三种蛋白的表达与临床因素的关系

三种蛋白在癌组织中的表达与年龄、性别、脉管癌栓无关（P＞0.05），但与胃癌的病理分期、淋巴结转移相关（P＜0.05）（表2）。

3 讨 论

图5 HIF-1α+与CD206+在胃癌组织中表达的相关性分析

肿瘤微环境在肿瘤的进展和转移过程中起着重要的作用，导致肿瘤恶性倾向和化疗抵抗等行为［3，4］。慢性炎症有助于癌症进展，并可能增加不同类型癌症的易感性［6］。巨噬细胞构成了肿瘤微环境中最主要的炎症细胞之一，被称为肿瘤相关巨噬细胞（TAM），分为M1 和M2 型巨噬细胞，M1型巨噬细胞分泌iNOS、TNF 等炎症因子，促进炎症发生，防止细菌、病毒、真菌等感染，抑制肿瘤发展；而M2 型分泌IL-10、TGF-β等抗炎因子，参与组织修复、血管生成、肿瘤进展，还可以抑制免疫细胞活性，诱导机体对肿瘤的免疫耐受［1］。在肿瘤微环境中，不同的免疫细胞被癌相关的信号招募且癌细胞和免疫细胞相互影响、促进［7］。

研究证实，脑、胃、乳腺、肝脏、结肠等癌肿内，缺氧影响着患者的生存期［6］。肿瘤缺氧可以通过募集的M2 型TAM 分泌VEGF 等促血管生成因子促进肿瘤新生血管的形成、降解细胞外基质，促进癌细胞的增殖、侵袭和转移［9］。此外，在应对缺氧时，HIF-1α稳定表达并转移至细胞核内和HIF-1β形成功能化的异源二聚体，继而激活胃癌血管生成、侵袭、能量代谢、肿瘤生长及不良预后等一系列基因的表达，HIF-1α是组织缺氧主要标志物［10］。HIF-1α与胃切除术后患者的总生存率和无病生存率密切相关，HIF-1α的高表达被认为是一种有前途的独立预后生物标志物［11］。同时，缺氧区域的TAM 介导了多种肿瘤的治疗抵抗，从而促进癌的复发［12］。

CD68 是一种相对分子质量为110 000 的细胞浆糖蛋白，与溶酶体颗粒有关，主要表达于单核细胞、巨噬细胞，是巨噬细胞最可靠的标志物［13］。文献报道 CD68+TAM 可以促进前列腺癌［14］、肺癌［15］、脑癌［16］等患者预后。而CD68+TAM 与子宫颈癌［17］、膀胱癌［18］、乳腺癌［19］、胃癌［1］等预后差直接相关。CD206是M2型巨噬细胞的主要标记物之一，CD206的表达高低及数量可以反映巨噬细胞浸润的数量，与肿瘤恶性程度及预后明显相关［20］。

表1 三种蛋白在胃癌及癌旁组织的表达情况

本研究通过免疫组化技术测定了胃癌和癌旁组织中的CD68、CD206、HIF-1α的表达，发现均明显高于癌旁组织，说明胃癌组织存在缺氧状态、胃癌细胞可释放活性因子招募单核细胞往肿瘤微环境中浸润并分化为TAM，形成正反馈。同时，三种蛋白在胃癌中的表达与年龄、性别等因素无关，而与患者的病理分期、淋巴结转移相关。胃癌组织中CD206+细胞数与HIF-1α+细胞数表达呈正相关，说明胃癌缺氧区域HIF-1α的表达可能对M2 型巨噬细胞有趋化作用或者促进巨噬细胞往M2 型极化，加重恶性循环，促进胃癌发生发展。