转基因技术提高大豆对非生物胁迫耐受性的研究进展*

轩慧冬，黄颜众，郭 娜，邢 邯

（南京农业大学大豆研究所/国家大豆改良中心/农业部大豆生物学与遗传育种重点实验室/作物遗传与种质创新国家重点实验室，南京 210095）

大豆（Glycine max（L.）Merr.）通称黄豆，古称菽，在中国大豆种植的历史大约有五千年，是世界公认大豆起源地。大豆在中国及世界各地均有栽培，世界各国的大豆是从中国通过不同途径直接或间接传播过去[1]。普遍公认的大豆传播途径是由中国在公元前三世纪传入朝鲜，在六世纪传至日本，约在三百年前传入菲律宾与印度尼西亚，在十八世纪以后传入欧美国家[2]。据相关记载，大豆在新石器时代被人类当作重要的粮食作物[3]。如今，大豆作为中国五大主要农作物之一，是重要的农业产品，而且用途也十分广泛。大豆种子中具有大约40%的优质植物蛋白[4]，其蛋白含量远远高于小麦、玉米、大米、牛肉和猪肉，可为人们提供主要的植物蛋白来源，有“田中之肉，营养之王”之称。大豆种子中富含多种氨基酸和维生素等，可以为人们提供优质的营养。大豆常用来提取蛋白质、榨取豆油、酿造酱油和做各种豆制品，同时，豆秸磨碎后可作家禽牲畜的饲料。大豆蛋白在非食品用途中的应用也很多，如在制造塑料、胶黏剂、织物纤维和可食性包装膜中等方面的应用[5]。

1938年，中国的大豆总产量超过世界大豆总产量的90%[6]。1996年，中国的大豆进口量已经超过出口量。据海关总署统计，2017年，中国进口大豆总量已经达到9 552.6万t，占全球大豆贸易量70%，成为全球第一大大豆进口国。2019年，中国大豆进口总量为8 551.1万t，为历史第二高峰。近年来，中国从国外进口的大豆均为转基因大豆。目前，中国人口的数量不断增加，人均可利用耕地却逐年递减，为满足人们的粮食需求，国家需要在有限的可利用耕地上去种植更多的粮食作物，这使得大豆的种植面积逐渐减小。随着全球经济飞速发展，环境生态问题愈发的严重，全球气候逐渐变暖，使中国干旱与半干旱的地区发生干旱、高温、盐渍等逆境胁迫的概率越大频率越高，严重影响中国大豆的生产，使得中国的大豆生产总量远远低于国民对大豆的整体需求。如果仅靠扩大规模生产大豆无法从根本上解决这种供需矛盾，而解决该问题的关键是必须通过育种手段来培育高产、优质、高抗的大豆新品种[7]。传统的大豆育种进程周期较长，工作量大，出现目标性性状的概率低，但转基因育种的出现可在很大程度上弥补传统大豆育种存在的缺点，加快大豆育种的进程。

转基因技术是指将目的DNA片段转入特定受体生物中，使其与受体本身的基因组进行整合，再经过数代的人工选择，从而获得具有稳定遗传目标性状的个体。该技术的出现和利用使培育目标性状新品种的速度更快效率更高。转基因技术在植物的发展史上，最早的转化方法是农杆菌介导转化技术。在1987年出现了基因枪法，通过基因枪法Sanford将质粒导入到植物的细胞，获得了转基因水稻和洋葱等[8]。1994年5月，美国孟山都公司培育的抗草甘膦除草剂的转基因大豆首先获准在美国商业化种植。中国在2008年启动并实施了转基因生物新品种培育重大专项，加快了中国植物转基因技术的研究步伐[9]。有报道从专利的角度比较了欧盟、美国、中国等国家和地区的转基因大豆的申请状况，发现欧盟和美国对大豆转基因技术几乎处于垄断状态，而中国申请的专利技术相对较少[10]。目前，中国转基因大豆的育种研究正处于快速发展阶段，已经通过大豆转基因技术获得了较多提高大豆对非生物胁迫耐受性的候选材料，但仍没有进入商业化生产阶段。大豆转基因技术在利用的过程中也会存在一些问题，如遗传转化效率低、假阳性率偏高等，但随着大豆转基因技术的不断发展，其优势不断增强和其存在的问题也不断被解决。面对日益严峻的环境条件和恶劣的土壤条件，使中国大豆耐逆育种面临更大的挑战。与传统大豆育种方式相比，运用大豆转基因技术培育的高产、耐逆的大豆新品种具有周期更短目标性更强的优势，对保护生态环境、提高大豆产量和推动大豆育种具有重要的作用[11]。因此，对利用转基因技术来提高大豆对非生物胁迫耐受性的研究进行综述对于大豆生物工程育种具有十分重要的意义。

1 转基因技术提高大豆的耐旱性

在全球气候变暖和中国水资源短缺的背景下，中国干旱、半干旱地区发生干旱的强度和频率增加，干旱灾害发生逐渐呈现出常态化[12]。同时，大豆属于需水量较大的作物，干旱胁迫严重影响了中国大豆生产产量。因此，利用转基因技术研究培育耐旱的大豆品种具有重要的意义。转基因技术对大豆耐旱性的提高，主要是通过利用转基因技术提高一些转录因子与干旱胁迫相关的响应蛋白表达来实现的。有研究发现一个新的R2R3-MYB转录因子GmMYB84可以增强大豆的耐旱性，GmMYB84过表达的植株表现出更低的叶片失水率与相对含水量，高效的ROS的产生和清除效率和改变胁迫相关基因的表达来提高耐旱性[13]。同时，也有研究发现大豆GmNAC8转录因子与其互作蛋白大豆GmDi19蛋白可以正调控大豆的耐旱性[14]。WRKY转录因子是植物中较大的转录因子家族之一，在其他植物中发现WRKY转录因子可以广泛参与生物与非生物胁迫并起作用。Wei等研究发现在大豆中过表达GmWRKY57基因可以通过激活ABA与Ca2+信号通路中的基因来提高大豆的耐旱性[15]。DREBs属于AP2/EREBP类转录因子，与其靶基因启动子区域的DRE元件特异性识别和结合，激活逆境响应有关的靶基因表达提高植物抗逆性[16]。利用大豆稳定遗传转化的方法研究者将小麦中TaDREB3a基因导入大豆中，经鉴定发现与对照相比表达TaDREB3a的转基因大豆具有更高的耐旱性[17]。植物体内的干旱响应蛋白受干旱胁迫的诱导并与植物的耐旱性相关。Wang等研究人员鉴定了一个大豆干旱响应蛋白GmRD22，该蛋白在干旱胁迫下可能调控细胞壁过氧化物酶进而增强细胞壁完整性，使GmRD22过表达植株表现出较强的耐旱性[18]。秦迪等分析转甜菜碱醛脱氢酶基因BADH转基因大豆的抗旱性分析发现，在干旱胁迫下过表达BADH基因的株系在萌发期的发芽指数比非转基因大豆提高2.5%～16%，达到了显著水平，苗期转BADH基因的株系也表现更强的抗旱性[19]。

2 转基因技术提高大豆的耐盐性

全球有近1/3的土地是盐碱地，而我国的盐渍土地面积占比较大，并且有约7%耕地土壤发生严重的盐渍化[20]。大豆属于中度耐盐品种，高浓度盐胁迫会使植株体内积累过量的盐离子进而降低大豆种子的发芽率严重时影响成熟期大豆的产量[21]。目前相关研究人员已克隆得到的相关耐盐基因包括GmSIN1、GmNEK1、GmDREB6、GmGT-2B等，并验证其在大豆耐盐性方面的功能机制。大豆SALT INDUCED NAC1（GmSIN1）编码受盐胁迫诱导表达的大豆NAC转录因子，在大豆中过表达GmSIN1通过促进根系的伸长提高大豆的耐盐性，并且在盐胁迫下过表达GmSIN1大豆与对照相比具有更高的产量和更优良的农艺性状[22]，说明大豆GmSIN1基因是大豆耐盐分子育种的优良候选基因。有研究表明过表达大豆的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因GmNEK1可以促进转基因植株的生长并且可以提高转基因大豆的耐盐性[23]。将大豆GmDREB6转录因子通过转基因技术将其转化到大豆中，发现过表达GmDREB6转基因大豆与对照相比积累了更多的脯氨酸来提高对盐胁迫的耐受性[24]。李冬梅等研究人员发现在盐胁迫条件下，GmGT-2B过表达转基因大豆与非转基因大豆相比有更高的耐盐性[25]。除了大豆内源基因的表达可以可高耐盐性，将其他植物的外源基因导入到大豆体内也可以增加大豆的耐盐性。有研究发现在大豆中过表达桃自由基清除剂CuZnSOD编码基因PpCuZnSOD可以显著增加转基因大豆植株的SOD活性水平来缓解盐胁迫对大豆的氧化损伤，进而提高大豆的耐盐性[26]。

3 转基因技术提高大豆的耐热性

近50年来全球温度升高速率呈近线性趋势增加，约是过去100年的2倍[27]。最适大豆发芽和成熟期的生长温度为15～22℃、开花期为20～25℃，当环境温度高于28℃时能影响大豆的正常生长发育进程，温度的不断增加会对大豆产生热胁迫。高温胁迫影响大豆的光合作用、呼吸作用和蒸腾作用等，进而影响大豆籽粒的生长发育严重时甚至会导致大豆产量急剧降低[28]。目前，通过转录组测序等方法，已鉴定了一些与大豆高温胁迫有关的转录因子及相关蛋白。吴广锡等将大豆热激转录因子GmHsFA1基因构建到植物的表达载体上，通过农杆菌介导的大豆子叶节稳定遗传转化方法将GmHsFA1基因导入高产品种黑农53中，对GmHsFA1过表达植株进行高温胁迫处理，发现GmHsFA1过表达植株的耐热性比受体黑农53大豆品种有显著高[29]。在高温条件下，植物体内的蛋白质会发生结构的变化甚至变性，而热激蛋白可被热胁迫诱导表达，帮助植物体内的部分蛋白恢复其原有的空间构象或生物活性，使相关蛋白在高温条件下维持正常功能。戎洁等从大豆JN18品种中克隆出了小热激蛋白基因HSP17.4，将其转化到受体大豆JN18中，对获得单拷贝的GmHSP17.4过表达转基因株系与受体进行耐热性鉴定发现与大豆JN18相比GmHSP17.4过表达转基因株系的耐热性更强[30]。本实验室研究表明与对照大豆品种天隆一号相比，利用转基因技术将大豆GmHsp90A2基因导入大豆品种天隆一号产生的过表达GmHsp90A2转基因大豆株系具有较强的耐热性，相反利用Crispr/Cas9技术产生的GmHsp90A2敲除突变体的耐热性较差[31]，表明大豆GmHsp90A2正调控大豆的耐热性，是大豆耐热性育种的有力候选基因。

4 转基因技术提高大豆的双重耐逆性

在大豆的生长过程中，除了遭受单一的逆境胁迫，很多时候会发生混合胁迫，例如干旱与盐胁迫、干旱与热胁迫等。目前，大豆中已经鉴定到一些提高双重逆境胁迫的胁迫应答基因，如bZIP转录因子，WRKY转录因子、晚期胚胎发育丰富蛋白，热激响应因子等。bZIP转录因子是植物体内的重要转录因子家族，广泛参与植物的生长发育和各种逆境胁迫过程。李媛媛等研究人员对大豆bZIP转录因子家族A亚族成员GmFDL06基因的过表达转基因株系与受体大豆品种东农50进行抗旱和耐盐性的鉴定发现，GmFDL06基因的过表达转基因株系与受体品种相比有更高的相对植株高度和干物质量以及更强的抗旱和耐盐性[32]。将大豆WRKY转录因子GmWRKY12转入到大豆Williams 82获得过表达转基因株系，将过表达GmWRKY12转基因株系与Williams 82进行干旱和盐胁迫，结果发现过表达GmWRKY12转基因株系的耐旱性与耐盐性比Williams 82更强[33]。有研究报道了一个新的晚期胚胎发育丰富蛋白GmSYP24基因参与ABA信号通路，将GmSYP24基因在大豆中进行过表达获得GmSYP24过表达转基因株系并对其进行耐旱与耐盐性鉴定，表明GmSYP24过表达转基因株系比对照有更强的耐旱与耐盐性[34]。李秀英等在盐和干旱胁迫下对3个转BADH基因大豆株系和非转基因受体吉农17的发芽、植株生长及主要农艺性状进行了鉴定，结果表明转BADH基因大豆株系较非转基因大豆的抗旱性、耐盐性明显提高，但是二者的主要农艺性状间没有明显差异[35]。吴广锡等研究人员对转GmHsFA1基因的过表达株系进行耐热和抗旱性的综合鉴定，结果表明与对照相比，大豆GmHsFA1过表达株系的耐热和抗旱能力有更大的提高[24]。

5 转基因技术提高大豆的其他耐逆性

大豆的生长过程中除了出现上述的逆境胁迫外，还可能遭受土壤的低氮、铝离子胁迫等。为适应这些胁迫，大豆可以通过调控相关胁迫诱导蛋白的表达来减弱逆境胁迫的损伤。在大豆生长发育过程中，氮素是必不可少的元素之一[36]。徐伟等研究发现在低氮胁迫下过表达细胞自噬过程相关基因GmATG8c转基因大豆株系与受体大豆品种相比，过表达GmATG8c的转基因大豆株系的低氮耐受性和单株产量均显著高于受体大豆品种，说明GmATG8c基因是具有提高氮素利用效率的一个有力候选基因[37]。全球可用耕地的40%为酸性土壤，如果酸性土壤的pH＜5.5时，土壤中的铝会以Al3+形式存在，会对大豆产生铝离子胁迫进而抑制大豆的生长发育。李莎通过发根农杆菌大豆转化方法研究柠檬酸转运体家族的GmAACT1和GmALF5基因在耐铝胁迫中的功能，研究发现过表达GmAACT1和GmALF5基因对大豆Al3+胁迫有一定程度的缓解作用[38]。大豆属于喜磷农作物，磷元素不仅是大豆遗传物质的重要组成元素也广泛参与大豆体内的酶促反应和新陈代谢过程[39]。在我国有大约2/3的耕地处于缺磷状态并且土壤中有效磷含量较少[40]，磷元素的短缺严重制约了大豆的生长发育及产量。有研究发现将水稻中磷转运体OsPT2和OsPT6稳定转化到大豆中，与对照相比过表达OsPT2和OsPT6的转基因株系低磷耐受性有所提高[41]。

随着基因组学、蛋白组学、转录组学和代谢组学研究的飞速发展，科研人员已经鉴定到许多大豆非生物胁迫相关的功能基因。同时，我国的大豆转基因技术发展水平处于世界前沿水平，可以准确快速有效的对已经鉴定到的非生物胁迫基因进行功能的鉴定。对于日渐严峻的环境条件对我国大豆生长造成的影响，利用转基因技术可以准确快速的提高大豆对非生物胁迫的耐受性，如耐旱性、耐盐性、耐热性、低氮耐受性等，保证大豆处于逆境胁迫条件时尽可能减少对大豆产量的损失。但是，关于转基因大豆的相关耐逆性研究只是处于实验室研究、转基因安全中间试验和环境释放阶段，还没有进行大面积推广和用于商业化生产[42]。目前，我国已经建立了转基因安全评价和检测体系，逐步优化的转基因大豆稳定遗传转化体系，已有许多获得我国自主知识产权的基因和具有潜在应用价值的转基因材料。依据我国大豆生产区的生态环境，相信不久的将来我国转基因大豆可以实现商业化生产，提高大豆在逆境胁迫下的产量，对我国大豆耐逆育种产业的发展具有重要意义。