基于网络药理学莪术抗阴道炎的机制研究△

黄志琼 刘 丽 杨 洁 陈晶晶 林文静 温高静 吕杰强

(温州医科大学温州市第三临床学院(温州市人民医院) 温州 325000)

阴道炎是指由不同致病菌引起的各种阴道黏膜炎性疾病的总称，是最常见的女性生殖系统感染性疾病。由于该病会反复发作，且在女性的各个年龄阶段都较容易发生，往往影响着大多数妇女的生活质量，造成很多困扰。目前西医治疗阴道炎多以抗菌药物为主，但许多控制炎症的杀菌药品会使患者出现不良反应。中医治疗阴道炎秉着“治外必本诸内”的原则，将内服与外治、整体与局部相结合进行论治，有较好的疗效。

莪术始载于《药性论》，是姜科植物蓬莪术、温郁金和广西莪术的干燥根茎。研究表明，莪术具有抗肿瘤、抗血栓、抗氧化、抗炎、抗病毒等作用[1]。由于中药具有多成分、多途径、多靶点协同作用的特点，因此从单一的角度并不能全面地阐释莪术的药理作用。

随着系统生物学的出现，网络药理学是在组学数据分析、网络数据库检索及计算机虚拟计算的基础上，系统地探索药物药效及作用机制的一种研究方法，网络药理学的研究思路注重系统性和整体性，这与中医药整体观相一致，被用来探索中药的分子作用机制。本研究从网络药理学的角度预测莪术抗阴道炎的作用靶点和信号通路，进一步分析其抗阴道炎的作用机制。

1 方法

1.1 莪术小分子化合物信息的获取

从TCMSP数据库(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform)中获取，按照 OB (Oral bioavailability) ≥30%、DL (Drug-likeness) ≥0.12 的筛选条件，共筛选出具有良好口服利用度和类药性的候选化合物11个。

1.2 莪术活性组分的靶标筛选

应用TCMSP数据库查询莪术活性组分对应的靶蛋白，以Uniprot (https://www.uniprot.org/)数据库查询靶蛋白对应的基因简称。UniProt 是一个集中收录蛋白质资源并能与其他资源相互联系的数据库，也是目前为止收录蛋白质序列目录最广泛、功能注释最全面的一个数据库。

1.3 阴道炎相关靶点的筛选

从GeneCards (The Human Gene Database)[2]和人类孟德尔遗传综合数据库(online mendelian inheritance in man,OMIM)[3]数据库筛选阴道炎的相关疾病靶点，以“vaginitis”为关键词进行检索，获取、筛选并建立阴道炎相关靶点数据集。

1.4 莪术活性组分与阴道炎共有靶标基因的获取

将类OB ≥30%、DL≥0.12的莪术活性组分对应的靶标基因与阴道炎对应的靶标基因取交集，获得莪术活性组分抗阴道炎的靶标基因。

1.5 蛋白-蛋白相互作用分析(Protein-Protein Interaction, PPI)

将交集得到的基因应用STRING[4]数据库构建蛋白相互作用网络，得到莪术抗阴道炎的体内反应网络。

1.6 “阴道炎-基因-靶标-莪术”网络的构建及分析

阐明莪术活性组分与阴道炎靶点之间的关系，将莪术活性组分、活性组分对应的靶点、阴道炎的靶标和交互蛋白靶点构建“阴道炎-基因-靶标-莪术”网络，将莪术化合物抗阴道炎的化合物-靶点信息导入Cytoscape[5]软件进行可视化分析,并分析各靶点的相关拓扑参数。

1.7 基因富集分析

采用Cytoscape的Cluego分析工具对相互作用基因进行了GO分子功能分析、GO生物学过程分析和KEGG ( Kyoto encyclopedia of genes and genomes)[6]靶点通路富集分析，进一步说明中药化合物的靶点蛋白在基因功能和信号通路中的作用。

2 结果

2.1 莪术小分子化合物和相应靶标的虚拟筛选

按照阈值设定 OB (Oral bioavailability) ≥30%、DL (Drug-likeness) ≥0.12，共筛选出具有良好口服利用度和类药性的候选化合物12个(表1)，通过TCMSP共检索出73个靶蛋白，并通过Uniprot数据库将预测出的靶点蛋白名转换为基因名，去除重复的基因名后共获取27个靶基因。

表1 莪术活性组分的筛选

Mol IDMolecule nameOB %DLMOL000296hederagenin36.910.75MOL000474(-)-Epoxycaryophyllene35.940.13MOL000889isocurcumenol97.670.13MOL000891(1R,10R)-epoxy-1,10-dihydrocurdione36.730.12MOL000897(3S,3aR,8aR)-3,8a-dihydroxy-5-isopropylidene-3,8-dimethyl-1,2,3a,4-tetrahydroazulen-6-one38.70.12MOL000901BRN 309458587.820.13MOL000902curcumol103.550.13MOL000903Gweicurculactone42.920.14MOL000906wenjine47.930.27MOL000915(1S,10S),(4S,5S)-germacrone-1(10),4-diepoxide30.480.18MOL000940bisdemethoxycurcumin77.380.26MOL000296hederagenin36.910.75

2.2 阴道炎靶标检索

通过GeneCards和OMIM数据库检索与阴道炎相关的基因，共检索出1569个基因。

2.3 莪术活性组分与阴道炎共有靶标基因的获取

将莪术活性成分对应的27个靶基因和阴道炎1569靶基因进行汇集，生成14个两者共同作用的基因，见表2。

表2 莪术活性组分与阴道炎共有靶标基因

靶蛋白基因Progesterone receptorPGRNuclear receptor coactivator 2NCOA2Muscarinic acetylcholine receptor M3CHRM3Prostaglandin G/H synthase 1PTGS1Sodium channel protein type 5 subunit alphaSCN5AProstaglandin G/H synthase 2PTGS2Retinoic acid receptor RXR-alphaRXRAAcetylcholinesteraseACHECathepsin DCTSDTrypsin-1PRSS1Glucocorticoid receptorNR3C1Estrogen receptorESR1Androgen receptorARMineralocorticoid receptorNR3C2

2.4 莪术抗阴道炎的体内反应网络

将莪术和阴道炎共同作用的14个靶标基因通过STRING 数据库构建“蛋白-蛋白”互作网络(图1)，该网络包含14个节点，平均节点度为3.57，平均局部聚类系数为0.628。

2.5 “阴道炎-基因-靶标-莪术”网络的构建

为了更清晰直观地阐释术抗阴道炎的复杂网络关系，运用Cytoscape3.7.1构建“阴道炎-基因-靶标-莪术”网络图并进行可视化(图2)，绿色长方形节点代表莪术关键活性成分，黄色圆形节点代表莪术与阴道炎交互的基因。该网络包含21个节点和86条边，体现了中药的多成分、多靶点相互作用的复杂网络关系，验证了莪术对治疗阴道炎是通过多途径、多环节、多靶标，整体协同的方式发挥作用的。

图1 莪术作用于阴道炎的蛋白互作网络

2.6 基因富集分析

为了阐明莪术治疗阴道炎作用的分子机制，利用采用Cytoscape 3.7.1的Cluego分析工具对相互作用基因进行了GO分子功能分析、GO生物学过程分析和KEGG靶点通路富集分析。

2.6.1莪术治疗阴道炎的GO基因分子功能分析

富集分析得到3条P≤0.05的分子功能分类，依次是类固醇激素受体、转录因子活性/配体调控特异性序列DNA结合、核受体活性。

2.6.2莪术治疗阴道炎的GO生物学过程分析

富集分析得到9条P≤0.05的生物学过程分析，排名前5位的生物学过程依次是女性妊娠的母体过程、妊娠的乳腺分支导管、前列腺上皮形态形成、分支导管参与乳腺导管形态发生、前列腺形态发生。

2.6.3莪术治疗阴道炎的潜在靶点KEGG 通路富集分析

利用Perl和R语言编程，对筛选出的基因进行KEGG 通路富集分析，得到2条信号通路，分别为雌激素信号通路、甲状腺激素信号通路，表明莪术的有效成分可以作用于这些信号通路达到治疗阴道炎的目的。

图2 “阴道炎-基因-靶标-莪术”相互作用网络

3 讨论

阴道炎作为一种妇科疾病，临床症状主要见于阴道分泌物增多、阴道疼痛、白带增多等症状，从而使得女性身体健康受到严重威胁[7]。目前西医治疗多以抗生素为主，但易产生耐药性，且可能会引起菌群失调而致经久不愈的阴道炎。因此，寻求疗效好而副作用小的治疗阴道炎的方法及药物成为十分重要的研究课题。网络药理学为莪术抗阴道炎的作用机制提供潜在的药理学探讨基础，筛选出莪术中活性化合物，获取其作用靶点，映射得到其抗阴道炎的潜在靶点，建立“阴道炎-基因-靶标-莪术”网络图，从而有效验证及预测莪术治疗阴道炎的潜在靶标及通路，最终为探索莪术抗阴道炎的具体机制提供依据。

在本研究中，最终预测得到莪术药对抗阴道炎的7个化合物和14个作用靶点，其活性成分多样性和作用靶点多样性在一定程度上体现了成分和靶点之间复杂的相互作用，在一定程度上解释了“异病同治，同病异治”的物质基础。通过基因富集分析发现莪术治疗阴道炎的分子功能涉及类固醇激素受体、转录因子活性/配体调控特异性序列DNA结合、核受体活性等方面；主要生物过程涉及女性妊娠的母体过程、妊娠的乳腺分支导管、前列腺上皮形态形成、分支导管参与乳腺导管形态发生、前列腺形态发生等方面。KEGG通路富集分析发现，莪术活性成分相关靶点PGR、NCOA2、CTSD、ESR1、RXRA参与了雌激素信号通路、甲状腺激素信号通路。其中雌激素信号通路(Estrogen signaling pathway)由雌激素与雌激素受体结合后可以调节细胞核中的基因转录，或者激活细胞质中的激酶进而发挥其作用，雌激素主要参与炎症反应、新陈代谢、心肌细胞和干细胞的存活。研究表明，雌激素替代疗法已被成功用于阴道炎，但激素替代疗法可能会增加乳腺癌、冠心病和其他疾病的发生[8]。因此，优选一种安全的替代方案值得我们去探讨。我们猜测莪术可通过调控雌激素信号通路促进雌激素的分泌来改善阴道炎的发生发展过程，具体的作用机制有待进一步探讨。甲状腺信号相关通路是甲状腺功能的重要组成部分，当甲状腺功能异常时，其信号通路会出现异常。查阅国内外文献，目前尚无甲状腺激素及甲状腺受体与阴道炎相关性的研究；结合我们的网络药理预测的结果，推测莪术可通过调控甲状腺信号通路来影响激素的分泌从而改善阴道炎的发生发展过程，仍需进一步实验验证。本研究发现，莪术治疗阴道炎的靶点参与了雌激素信号通路(4个靶点)、甲状腺激素信号通路(3个靶点)，表明莪术中的活性成分可能通过参与上述通路，进而减轻机体炎症反应、从而发挥治疗阴道炎的作用。

本实验运用网络药理学的方法报道莪术抗阴道炎的作用机制，成功地预测了莪术治疗阴道炎主要作用的靶点与相关的信号通路，发现莪术通过多成分作用于多靶点发挥药理作用，为进一步深入探讨作用机制奠定基础。