不同裂解方法对精子蛋白提取的影响

郭润发，张立新，朱文凯，周延东，毛 静，葛红山

（泰州市人民医院 生殖医学科，江苏 泰州 225300）

蛋白免疫印迹实验（Western blot）是一种通过SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨特异性蛋白的方法，被广泛用于检测基因表达产物或比较表达产物量的相对变化，获得高品质的蛋白样本是保证其结果准确的前提条件。目前提取蛋白所用的裂解液种类繁多，裂解时间、裂解方法等均会影响蛋白的提取效果，应用于后续的Western blot 检测时效果具有较大的差异[1]。目前实验室最常用组织细胞裂解液是经典的RIPA 裂解液，然而研究发现使用RIPA buffer 提取精子蛋白并不理想[2,3]，精子细胞是一种高度分化的细胞，精子的结构和功能都有别于其他体细胞，在其细胞内外存在着多种糖蛋白或糖复合物，它们参与精卵识别、粘附、结合以及质膜融合等受精活动，在受精过程中起着非常重要的作用[4]。但是由于精子蛋白在结构上的多型性、功能上的复杂性而且其表达量相对其他体细胞较低，选用恰当的裂解方法有效提取精子蛋白是个亟待解决的实验问题。

1 材料与方法

1.1 材料Percoll 硅胶颗粒混悬液（Solarbio）；SDS 裂解液、RIPA（强）裂解液、蛋白酶抑制剂（PMSF）、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、BeyoBlue™考马斯亮蓝超快染色液（碧云天)；β-actin 抗体、LonP1 抗体（Abcam）； 二抗anti-rabbit （中杉金桥）、蛋白marker 26616（Thermo）；一抗稀释液（杭州弗德生物有限公司），其他常用试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 方法

1.2.1 精子的采集及保存在经患者同意的前提下，选取我中心就诊的男性患者，年龄位于25～35岁之间，液化正常、浓度约50×106/ml、活动率约50%，畸形率正常的100 份男性精子标本。精液经室温30min液化后，将精液加到含有40%Percoll 分离液的离心管中,1500 rpm 离心15 min,收集底部沉淀并重悬于2 ml 精子洗涤液中1500 rpm离心10 min,弃上清液，将沉淀冻于-80℃保存备用。

1.2.2 精子总蛋白提取和浓度测定

1.2.2.1 不同裂解液对总蛋白提取的影响。将解冻后精子混匀计数，分6组，每组取100×106个精子分别加入100ul 的RIPA（强）或含有1%、2%、3%、6%、10%SDS 浓度的SDS 裂解液中，加入PMSF，震荡并室温裂解15 分钟后，12000rpm 离心10min 收集上清液，选用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.2.2 不同裂解时间对总蛋白提取的影响。将解冻后精子混匀计数，分3组，每组取100×106个精子分别加入100ul 含有1%SDS 浓度的SDS 裂解液中，加入PMSF，震荡并室温分别裂解5min、15min、25min 后，12000rpm 离心10min 收集上清液，选用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.2.3 不同裂解方法对总蛋白提取的影响。将解冻后精子混匀计数，分3组，每组取100×106个精子分别加入100ul 的含有1%SDS 浓度的SDS 裂解液中，加入PMSF，震荡并裂解15分钟后，组1直接12000rpm 离心10min 离心收集上清液；组2使用超声破碎仪冰上100 W超声4s间隔30s，重复5 次后离心收集上清液；组3 在超声后100℃煮沸10min，然后离心收集上清液，分别用BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.2.4 不同细胞量对总蛋白提取的影响。将解冻后精子混匀计数，分3 组，分别取100×106个、200×106个、500×106个精子分别加入100ul 含有1%SDS浓度的SDS裂解液中，加入PMSF，室温裂解15min 后，12000rpm 离心10min 收集上清液，选用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。

1.2.3 考马斯亮蓝染色分析 配制分离胶浓度8%，浓缩胶浓度5%SDS-PAGE 凝胶，取30mg 总蛋白上样，并使用羊水细胞作为阳性对照，与marker 同时120V 电泳；电泳至距胶底部停止电泳。取下凝胶，加入染色液染色60min 后，加入适量去离子水，在摇床上摇动脱色。每隔约10～30min，更换新的去离子水，更换3次后，继续在摇床上脱色过夜。

1.2.4 Western Blot 分析 配制分离胶浓度8%，浓缩胶浓度5% SDS-PAGE 凝胶，取40mg 总蛋白上样，与marker同时120V电泳；分离蛋白后半干转膜，随后将膜置于5%牛奶封闭破中室温孵育2 h；LonP1、β-actin 抗体（Abcam）（1 : 2000）4 ℃过夜孵育；TBST 缓冲液充分洗膜，二抗anti-rabbit（1:4000)室温孵育2 h。TBST 缓冲液充分洗膜后ECL高敏感化学发光试剂显色，扫描图片并拍照。每个实验样本均重复3次。

1.3 统计学方法应用SPSS 21.0统计软件分析数据。计量资料以±s表示，若满足正态分布及方差齐性的条件，多组间比较采用单因素方差分析，多组间中的两两比较采用SNK-q 检验，若不符合正态分布，则采用非参数检验进行比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同裂解液对总蛋白提取的影响比较6 组不同裂解液发现，通过SDS 裂解液处理获得的总蛋白含量明显高于RIPA组（P＜0.05），但不同SDS浓度裂解液获得的总蛋白浓度并无显著差异（P＞0.05），见表1。

表1 不同裂解液对总蛋白提取的影响

2.2 不同裂解时间对总蛋白提取的影响比较3组不同处理时间发现，处理时间延长总蛋白浓度并无显著差异（P＞0.05），见表2。

表2 不同裂解时间对总蛋白提取的影响

2.3 不同裂解方法对总蛋白提取的影响比较3组不同方法发现，超声后高位煮沸提取的总蛋白浓度最高，显著高于震荡组（P＜0.05），见表3。

表3 不同裂解方法对总蛋白提取的影响

2.4 不同细胞浓度对总蛋白提取的影响比较3组不同细胞浓度裂解结果发现，细胞浓度越高获得的总蛋白量越高（P＜0.05），见表4。

表4 不同细胞浓度对总蛋白提取的影响

2.5 SDS-PAGE电泳结果电泳后的凝胶，经考马斯亮蓝超快染色液染色后，结果显示不同处理方法之间蛋白条带的数量差异不明显，但1%SDS裂解液震荡处理15min 在蛋白强度上要优于其他各组。通过使用羊水细胞作为阳性对照发现，精子细胞在蛋白表达丰度上都低于体细胞，见图1。

2.6 Western blot 结果利用β-actin 和LonP1 抗体检测通过在SDS裂解液中超声后煮沸提取的精子蛋白，β-actin和LonP1条带均能清晰表达，见图2。

图1 SDS-PAGE电泳结果

图2 Western blot结果

3 讨论

精子是一种不同于其它组织和细胞的生殖细胞，在生命的繁衍过程中精子细胞承担着特殊的使命，为了完成其生理功能，精子细胞的结构具有特异性，使其具有较强的韧性和抗酸碱能力，这无疑对于精子蛋白的提取构成了很大的困难，如何高效地获得高质量的精子总蛋白是研究精子与卵子的相互作用过程、分子机制的基础[5]。

本实验通过比较不同的裂解方法，寻找适合的精子细胞蛋白提取的裂解条件，以期为后续精子相关研究提供合适的蛋白提取和免疫印迹方法。研究结果显示，SDS 裂解液的裂解效率高于RIPA裂解液（P＜0.05），原因可能是RIPA裂解液中SDS含量过低，仅为0.1%。而精子膜结构较为特殊，SDS 裂解液中富含高浓度的SDS 能有效的破坏精子的磷脂双分子层，使其解离释放膜中的蛋白。但细胞的裂解和蛋白完整性的破坏是一对矛盾，采用强效的表面活性剂在提高细胞裂解效率的同时也增加了蛋白完整性破坏的概率。实验证明使用更高的SDS 浓度并不能有效增加获得的总蛋白浓度。因此，此次实验中最适合作为精子提蛋白的裂解液是1%SDS浓度的SDS裂解液。

为验证裂解时间对精子蛋白提取的影响，采用5min、15min、25min 裂解时间，比较发现并无显著性差异。除了改变裂解液，本实验还研究了通过物理手段提高裂解效率，发现通过超声后煮沸可显著提高精子的总蛋白的浓度（P＜0.05），原因可能是高温可以迅速使细胞裂解，充分释放蛋白，并能灭活蛋白酶，使总蛋白浓度提高。最后本实验研究了精子数目对总蛋白的影响，发现由于精子细胞是一种特化的细胞，其结构特殊，所携带蛋白量较少，使用尽可能多的精子数量进行蛋白的提取可以有效提高总蛋白含量，SDS-PAGE 和Western blot电泳结果显示，通过超声后煮沸的精子总蛋白在作为实验材料验证目的蛋白上并无差异，可用于Western blot 分析。综上所述，我们认为精子蛋白提取时应使用1%SDS裂解液，在尽可能短时间进行超声后煮沸，可以提取到最大限度的高浓度、高质量的精子蛋白，这无疑为后续研究精卵作用机制、受精机理的最终探明奠定了坚实的基础。