miRNA在乙型肝炎病毒及相关疾病中作用机制的研究进展

王 蔚，张丽丽，赵 川，王欣茹，张 会，尹有美

（泰州市人民医院 肝病科，江苏 泰州 225300）

乙型肝炎病毒（HBV）可以引起急性或慢性肝脏疾病，尽管目前有有效的疫苗，它仍是一个主要的全球健康问题。HBV发现于1966年，它是一种小的、有包膜的病毒，具有肝病毒科的部分双链DNA基因组。HBV已经影响了世界人口的三分之一，其中超过3.5 亿人患有慢性乙肝[2]。慢性乙型肝炎（CHB）患者肝小叶的结构被破坏，肝细胞再生结节增多，最终可发展为肝纤维化。肝脏的纤维化经常在不知不觉中进展，特别是在那些HBV携带者中发生，激活的免疫系统加速了肝纤维化的进展。HBV 感染是慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌（HCC）的关键风险因素。HBV 并不会直接损害肝细胞，HBV 感染造成的肝损害主要是由于宿主的免疫反应引起的。乙型肝炎的免疫发病机理取决于宿主因素（如年龄、性别、免疫状态），病毒和环境因素的错综复杂的相互作用。

微小RNA（miRNA）发现于1993年，是由19～23个核苷酸组成的非编码小RNA，主要通过配对靶转录物的3' 非编码区调控真核生物的基因表达。到目前为止，已发现超过2000 个人的miRNAs，大约60%的人mRNA 可成为miRNA 的靶标。miRNA 参与多种生理和病理功能，其中包括免疫应答和肿瘤发生。除此之外，miRNA是许多病毒-宿主相互作用的重要调节剂。越来越多的研究证实了多种病毒的复制可能受到不同的miRNA 的影响，包括疱疹、多瘤病毒、腺病毒、乳头瘤病毒等。成熟的miRNA 是一种在进化中高度保守的非编码小分子RNA。目前，在人类基因组中发现的成熟miRNA 分子已达2000 多种，调控着人类大约超过30%的蛋白质编码基因。尽管部分miRNA可以促进病毒复制，但某些miRNA 可以用作潜在的抗病毒剂。在这方面，艾滋病毒、HCV（丙型肝炎病毒）和HBV（乙型肝炎病毒）已进行了广泛的研究。由于复杂的生命周期和复杂的宿主反应，miRNA 在HBV 生物学中的作用是多方面的。HBV调节细胞miRNA的表达以增加其自身复制并从免疫应答中逃逸，并在感染的肝细胞中建立病毒的持续性增殖。通过HBV相关的信号调节途径如免疫应答、凋亡、增殖和迁移可以导致miRNA的失调表达。最近的研究发现，细胞外miRNA 能够在血清中循环，并且这些miRNA 是高度稳定的，这被认为可以在HBV的诊断与治疗中起到积极的作用。研究表明，一些宿主miRNA 可以通过多种方式调节HBV复制，某些miRNA直接靶向病毒RNA阻止其复制，也有miRNA靶向特异性宿主基因阻碍病毒繁殖，甚至某些miRNA 能够激活特异性免疫应答以抑制病毒。Dai 等[1]的研究表明miRNA-15b 通过人肝细胞核因子1α 激活HBV 增强子I 促进HBV 的复制，而HBx 的表达抑制了miRNA-15b 的表达。HBx 蛋白可调控抑癌基因miRNA-145、miRNA-21 和miRNA-222 的 表 达。也 有 研 究 表 明miR-98， miR-375， miR-335，miR-199a-5p 和miR-22 参与HBV 的复制与表达，并促进HCC 的发生与发展[2]。Sarkar[3]发现在乙型肝炎感染期间，miRNA-155的表达与Toll样受体7的表达正相关。此外，miRNA-34a 靶向CCL22 并通过调节T 细胞抑制HBV 感染。而miRNA-146a和miRNA-548 分别靶向STAT1 和IFN-λ1 以促进HBV感染。

1 miRNA的生物功能

1.1 miRNA 的生物发生细胞核中由RNA 聚合酶II 和III 转录的初级miRNA 被核糖核酸酶Drosha-DGCR8 复合物切除，并产生前体miRNA。这些前体miRNA通过Ran-GTP及蛋白-5转运至细胞质，并被称为Dicer 的RNAse III 酶切除，产生miRNA 双链体。这种双链体继而分裂产生单链成熟miRNA 最终形成RNA 诱导的复合物（RISC）。RISC 和Argonaute/ EIF2C（AGO）蛋白共同作用促进靶mRNA 识别。miRNA 识别靶mRNA 是通过miRNA 的5' 端（种子序列）和编码区和非翻译区（UTR），特别是mRNA 的3’-UTR 中位点之间的特异性碱基配对的相互作用。成熟的miRNA 通过靶基因序列抑制转录机制或诱导mRNA降解。

1.2 miRNA 的特征miRNA 基因在核内由RNA聚合酶II 转录成大约7000nt的初级微小RNA(primiRNA)，pri-miRNA 再经由核内的Drosha 酶及蛋白DGCR8识别，切割成长约70～80nt的miRNA前体（pre-miRNA），然后，其被转运蛋白（expor⁃tin5） 转运至胞质，在Dicer 酶（核酸内切酶Rnase Ⅲ）的作用下，进一步将pre-miRNA 切割成了22 个nt 的双链miRNA，其被解旋酶解旋以后，其中的一条链成为成熟miRNA。近来研究表明，miRNA 的表达具有时间特异性及组织特异性，其对基因的调控非常复杂，往往不是一对一的关系，一个miRNA 可能调控了数百个靶基因的表达，而一个靶基因也有可能由多个miRNA 共同调控，数量众多的miRNA与其不同的靶基因之间形成了一个错综复杂的基因表达调控网络。换句话说，如果miRNA 和靶mRNA 之间存在部分互补，其将导致转录的阻遏，而如果存在完全互补性，将导致靶mRNA 的降解。由miRNA 促进的mRNA 降解是通过诱导去腺苷酸化或抑制蛋白质合成、抑制帽识别时的翻译起始或诱导核糖体过早下降完成的。即使在细胞中生长停滞的情况下，成熟miRNA也可以增加靶基因的表达。

2 病毒miRNA与乙肝病毒研究的进展

2.1 miRNA和乙型肝炎X蛋白对宿主基因表达的调节虽然有许多病毒产生特定的miRNA 以操纵宿主的基因编码，到目前为止还没有证据证实HBV合成miRNA。有大量的研究认识到HBV调节不同的宿主miRNA，但只有少数确认了单个病毒蛋白在所述调节中的作用。有研究证实在所有病毒蛋白中，乙型肝炎X 蛋白（HBxAg）在调节宿主miRNA 中起到了特定功能，在HBx 表达细胞中上调7 个miRNA 并下调了11 个宿主miRNA。HBx靶向miRNA 的反向调节Ras，HMGA2，MYC 和STAT3的let-7家族（let-7a，let-7b和let-7c），可调节宿主肿瘤形成和免疫应答[4]。HBx蛋白也被发现具有上调miR-29a的作用，而miR-29a可反向增强肝癌细胞迁移。此外，HBx 可以下调miR-101，导致异常DNA 通过靶向DNA 甲基转移酶3 甲基化[5]。此外，已经证实通过HBx蛋白上调的miRNA-146a可下调补体因子H并促进肝炎的进展[6]。

2.2 miRNA调节乙肝病毒复制宿主与病毒的相互作用是目前研究的热点问题，而miRNA 在这种相互作用中起重要作用。到目前为止的多项研究证实，有大量的宿主miRNA 可以通过多种方式调节HBV复制，主要是抑制病毒复制。其中，某些miRNA 直接靶向病毒RNA 阻止其复制，也有miRNA 靶向特异性宿主基因阻碍病毒繁殖。甚至某些miRNA能够激活特异性免疫应答以抑制病毒。

2.2.1 miRNA 直接抑制乙肝病毒复制 在病毒基因组中具有靶序列的miRNA 可以直接靶向并抑制HBV。在一项研究中，Wu 等人[7]应用计算分析以确定在HBV基因组中具有靶位点的miRNA，筛选出了靶向聚合酶和表面基因let-7，miR-196b，miR-433，miR-511等。也有其他研究证实了某些miRNA可直接抑制HBV复制，包括miR122（靶向mRNA 的编码区、病毒聚合酶和HBV 基因组核心蛋白的3' -UTR 区）[8]，miR199a-3p（靶向HBsAg 编码区），miR210（靶向HBV 前S1 区），miR125a-5p（与HBV 表面抗原相互作用并抑制其表达）[9]，miR15a（靶向HBx 转录物，miR20a，miR-92a-1，miR-16-1（HBV 转 录物）[10]和miR205（靶 向X 基因）[11]。

2.2.2 miRNA 间接抑制乙肝病毒复制 某些miRNA在HBV基因组中没有直接结合位点但可以通过与其相关的其它宿主因子间接调节病毒复制、转录。在这方面，miR122已经被广泛研究。它是肝特异性的miRNA，通过复杂信号网络参与影响HBV感染。目前有些研究表明miR122增强病毒复制，而某些研究则发现其抑制病毒复制。例如，miR122通过靶向抑制血红素加氧酶-1促进病毒复制。而miR122 亦通过靶向CyclinG1 和NDRG3 抑制病毒复制。miR-141 和miR155 可以通过直接靶向PPARα（过氧化物酶体增殖物激活受体α）和C/ EBP-β（CAAT 增强子结合蛋白β）有效抑制HBV 复制。miRNA-130a 通 过 靶 向 作为HBV 转 录增强子的PGC1α和PPAR抑制HBV的复制[12]。

2.2.3 miRNA促进乙肝病毒复制 值得注意的是，没有确实的证据显示宿主miRNA 可直接促进病毒。然而，有些实验结果表明某些miRNA 可以增强病毒复制。例如，Dai 等人[1]的研究表明miR-15b 通过人肝细胞核因子1α 激活HBV 增强子I 促进HBV 的复制，而HBx 抑制miR-15b 的表达。也有研究结果显示miR-146a和miR-548通过抑制特异性宿主免疫因子促进HBV复制[13]。

2.3 miRNA 与HBV 治疗许多miRNA 可以抵抗HBV，但是没有相关的临床试验。在这方面，最重要的是miRNA 的输入，这是可能引起高度细胞毒性的。miR122，miR30和miR31已有相关研究。用于输入miR122 和miR31 的体miR 样序列的设计已经成功地实现了减少＞80%的病毒复制。需要关注的另一个重点是基于HBV感染的临床阶段的治疗管理。miR-29b 模拟物预防肝纤维化，而miR-99a模拟物显著抑制HCC期间的肿瘤生长。

3 miRNA与HBV感染的不同阶段

HBV是具有复杂生命周期的非细胞病变病毒。有研究已经开始着眼于与HBV感染的不同阶段相关的miRNA 的特异性作用。然而，这些研究的结果有时是矛盾的。值得注意的是肝脏疾病（慢性肝病，肝硬化和肝细胞癌）也可能由于多种其他感染如丙型肝炎病毒（HCV），丁型肝炎病毒（HDV），甲型肝炎病毒（HAV），戊型肝炎病毒（HEV）和环境因素（例如，酒精性肝病等）引起，并且存在特异性的miRNA作用其中。

3.1 慢性肝炎越来越多的研究揭示了肝脏特异性miR122 与慢性肝病相关。研究表明miR122 在HBeAg 阳性慢性肝炎患者血液样品中显著上升。也有实验显示miR372/373 随着HBV DNA 滴度的升高而上升，因此其可作为慢性肝炎的标志物。Chen 等 人 实 验 表 明let-7c，miR23b，miR122 和miR150可以用于诊断隐匿性HBV感染。

3.2 肝硬化miR29 在所有与肝硬化相关的miRNA中广为人知[8-12]。miR29与进展性肝硬化/纤维化及其程度呈负相关。肝硬化主要由于肝星状细胞（HSC）分泌的胶原沉积在肝细胞的细胞外基质。有研究显示miR29 通过TGF-β 和NF-κB 通路抑制HSC中的胶原分泌基因来抑制肝硬化/纤维化。miR133a 和miR199 在肝硬化/纤维化过程中下调，而miR181b，miR214-5p，miR221 和miR222 在肝硬化过程中上调并且因此可以充当标记物。

3.3 肝细胞癌HBV，特别是HBx 蛋白，可调节不同细胞miRNA 的表达并促进肝癌的发生。HBX蛋白促进miR-17-92 簇（mir-17-5p，miR-18a，miR-19a，miR-19b，miR-20a 和miR-92a-1）在HBV 相关的HCC 中升高。同样的研究也发现miR21 在HBV 相 关 的HCC 升 高。Laderio 等 强 调HBV 相关HCC 与非HBV 相关的HCC 相比，miR-96 过表达。有研究表明miR155 在HBV 相关的HCC 中上调。HBx 蛋白可使miR-122 表达失调。HBx 可通过启动子高甲基化诱导调节miR-205 和miR-132 的表达[14]。HBx 还通过抑制肿瘤抑制因子p53，减少miR-34，miR-23a，miR-148a，miR-192，miR-125b和miR-200的表达促进肝癌发生[15]。

4 miRNA多态性与HBV感染

miRNA 是基因功能的复杂调节物，miRNA 编码基因中的单核苷酸多态性（SNP）可能与HBV持久的易感性相关，并因此与HCC 发展相关。在韩国病例对照研究中，Cheong 等[16]发现miR-604基因上的T 等位基因是HBV 相关慢性肝病患者HCC 发生的保护因素。他们也发现miR-219-1 启动子中的T 等位基因与HBV 清除有强烈相关性。Yu 等人[17]发现microRNA-323b 多态性与乙型肝炎病毒的持续性相关，这种多态性促进病毒复制增强。Xiang 等[18]表明miR-499 多态性与HBV 相关HCC的易感性相关。Xu等人[19]的一项meta分析揭示了miRNA编码基因中存在三个常见的功能性SNP，即miR-146a G→C （rs2910164），miR-196a-2C（rs11614913）和miR-499 T→C（rs3746444）。他们发现编码miR-146a 和miR-196a-2 的基因中所含的SNP 可能在HCC 的遗传易感性中起主要作用，miR-146a C 变异与HCC 风险降低有关。miR-196a-2T变体与高加索人群中HCC的易感性相关。Su等人[20]的研究也支持miR-146a多态性在亚洲人HBV相关HCC的遗传易感性中可能发挥作用。

5 miRNA和宿主免疫应答

机体的免疫应答包括先天性固有免疫反应和后天性适应性免疫反应，两者之间相辅相成，共同维护机体的免疫稳态。近年来研究表明，miRNA 不仅参与了免疫细胞的发育和分化，也在机体免疫应答调控机制中发挥了重要的作用，是一类新型的免疫调控分子。但是，有关miRNA在宿主对HBV免疫应答中的作用的研究很有限。Su等人[21]研究发现miR155 靶向SOCS1，通过JAK-STAT 通路增强针对HBV的抗病毒反应。也有研究发现在乙型肝炎感染期间，miR155的表达与Toll样受体7的表达正相关。此外，miR-34a靶向CCL22并通过调节T细胞抑制HBV感染。而miR-146a和miR-548分别靶向STAT1和IFN-λ1以促进HBV感染。

6 结语

近年来，miRNA 对免疫反应的调控作用越来越受到关注，miRNA 被发现可作为基因功能的整体调节物。使用核苷类似物作为治疗策略的限制性和没有可用于反映HBV诱导的肝病阶段的合适生物标志物已受到研究人员的长期关注。大规模研究揭示，有些miRNA 可以被病毒调节以促进病毒复制，而有些miRNA 可以抑制病毒的复制。miR-155参与针对HBV的免疫应答介导病毒抑制，并可以触发细胞凋亡。也有研究[22]称miR155 参与肿瘤形成，这需要在未来研究中进一步证实。此外，血液循环中的miRNA 可作为生物标志物，并用于确定HBV临床阶段。总而言之，有关miRNA的研究对HBV及其相关肝脏疾病的诊断与治疗具有重要作用，具体机制有待进一步探索。