水力空化降解壳聚糖产物分子量分布的研究

张 帆　王鹏飞　黄永春

水力空化降解壳聚糖产物分子量分布的研究

张 帆1,2,3王鹏飞1,2,3黄永春1,2,3

（1.广西科技大学生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006；3.广西高校糖资源加工重点实验室，广西 柳州 545006）

文章在确定最佳水力空化降解壳聚糖工艺条件的基础上，采用凝胶渗透色谱法测定了壳聚糖不同时间降解产物的分子量分布。结果表明：水力空化降解壳聚糖的效果明显，壳聚糖降解产物的分子量下降显著，降解产物的分散度较原料壳聚糖也有所减小。

壳聚糖；水力空化；凝胶渗透色谱；分子量分布

壳聚糖（Chitosan）是甲壳素经脱乙酰基后得到的产物，是迄今发现的唯一天然碱性多糖［1］。由于壳聚糖来源广泛，且具有优良的生物相溶性和可降解性［2］，所以被广泛地用于化工、环保、食品、印染、纺织、医药等方面［3，4］。研究表明不同分子量的壳聚糖的性质差异很大，壳聚糖的许多功能特性只有当分子量降低到一定程度时才能表现出来。低聚壳聚糖不仅保持了高聚壳聚糖的某些功能性质，还具有某些特殊的生理活性［5］。因此，对壳聚糖降解方法及其产物分子量分布的研究具有重要的意义。水力空化是高效、简单的新型壳聚糖降解方法。笔者所在课题组前期研究表明，水力空化能够有效地降解壳聚糖［6，7］。

本文采用凝胶渗透色谱法测定水力空化降解壳聚糖不同时间降解产物的分子量及分布，为水力空化降解壳聚糖条件的优化、降解机理以及产物调控研究提供依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

壳聚糖：脱乙酰度90.91%，上海卡博工贸有限公司；冰醋酸：分析纯（AR），成都市科龙化工试剂厂；三水合乙酸钠：分析纯（AR），台山市粤侨试剂塑料有限公司；不同分子量的葡聚糖标准样品：T1（w=5200），T2（w=11600），T3（w=23800），T4（w=48600），T5（w=148000），T6（w=273000），T7（w=410000），T8（w=668000），Waters公司。

1.2仪器与设备

凝胶渗透色谱仪：Waters1515等度高效液相色谱泵；Waters 2414示差折光检测器；Ultrahydrogel 250A，500A，1000A色谱柱：尺寸300×7.8mm；Breeze version 3.30色谱工作站；分析天平：BS224 S型，德国赛多利斯股份公司；隔膜真空泵：GM-0.33，天津市腾达过滤器件厂；水力空化装置：自行研制。

1.3 方法

1.3.1水力空化降解壳聚糖实验条件的确定

根据前期对壳聚糖溶液浓度、溶液pH、反应温度、入口压力、反应时间、水力空化反应装置结构等因素对基于文丘里管水力空化降解壳聚糖过程的影响的实验优化结果，在壳聚糖溶液浓度为3g·L-1，溶液pH值为4.4，反应温度为40℃，入口压力为0.4 MPa，反应时间为120min，水力空化反应装置文丘里管的入口角度为60°，出口76°，喉部长度为10mm，喉部直径为4mm的条件下进行实验。配置浓度为0.2mol·L-1乙酸-0.1mol·L-1乙酸钠缓冲溶液（pH=4.4）3L作为溶剂。称取壳聚糖固体样品9g，缓慢倒入溶剂中，当壳聚糖溶解后，静置4h ，使壳聚糖能够充分溶解。

将配置好的3g·L-1的壳聚糖溶液倒入自制的水力空化装置（如图1所示），开启泵2，通过阀门V1控制进口压力为0.4MPa。开启冷凝水控制反应温度为40℃。

图1　水力空化设备示意图

1.3.2凝胶渗透色谱法测定壳聚糖的分子量及分子量分布

（1）壳聚糖降解液的预处理

在上述实验条件对壳聚糖进行降解。用移液管每10min取降解产物于25mL具塞试管中，然后利用移液器从试管中精确移取2mL于5mL容量瓶中，加入0.2mol·L-1乙酸-0.1mol·L-1乙酸钠缓冲溶液（pH=4.4），定容，得到浓度为1.2mg·mL-1的壳聚糖降解液。然后将此降解液经过0.45μm的微孔过滤器过滤后保存于试样管中待测。

（2）凝胶渗透色谱的实验条件

流动相：0.2mol·L-1乙酸-0.1mol·L-1乙酸钠缓冲溶液（pH=4.4），流动相经过滤器过滤并经超声脱气。

取经过过滤后的浓度为1.2mg·mL-1的壳聚糖降解液，进样量为25μL，选择检测器灵敏度为32，控制柱温为30℃，流速为0.6mL·min-1。

色谱柱：Ultrahydrogel 1000A，500A，250A三根串联使用。连接顺序按排阻限由大到小连接。

（3）分子量标准曲线的制作

分别将不同分子量的葡聚糖标准样品：T1（Mw=5200），T2（Mw=11600），T3（Mw=23800），T4（Mw=48600），T5（Mw=148000），T6（Mw=273000），T7（Mw=410000），T8（Mw=668000）溶解于流动相中，在上述色谱条件下测定标样，根据葡聚糖标样分子量的对数与其对应的凝胶色谱的保留时间的关系，经三元线性回归，得到标准曲线。

图2　葡聚糖标准样品凝胶渗透色谱图

图3　葡聚糖分子量标准曲线

线性回归方程为：

1.4数据分析

利用Breeze version 3.30色谱工作站与Excel 2010软件进行数据处理与分析。

2　结果与讨论

通过试验分别测定了不同时间降解产物的分子量及其分布。得到的色谱图中均含有峰1和峰2。实验表明，峰2的位置在水力空化降解过程中始终不发生变化，只是其信号响应强度大小有变化。通过分子量标准曲线计算表明，峰2的Mw为200 Da左右，且其分散度为1.2左右，分散度较为集中，推断峰2是小分子单糖的峰。峰2后的倒峰为溶剂峰，这里不予讨论。峰1在降解前后的位置和形状均发生变化。所以，本文讨论水力空化降解壳聚糖分子量及其分布的变化指的是峰1的分子量和分布的变化。

图4　不同时间降解产物的凝胶渗透色谱图

图5　不同时间降解产物的重均分子量

由图4可以看出，随着反应时间的延长，不同时间降解产物峰1的保留时间逐渐变长，这说明水力空化降解壳聚糖产物的分子量是逐渐变小的。结合表1和图5可以清楚的看出，随着反应时间的延长，壳聚糖的重均分子量Mw逐渐降低。降解产物的重均分子量在0 min～40min时下降较为显著，之后趋于平缓。这可能是因为，一方面，在反应的初期壳聚糖的分子链较长，分子量较大，糖苷键含量高，分子易于被切断。随着降解的深入、分子链的断裂，分子链的长度缩短，分子数量增多，可降解的糖苷键减少，机械力与空化效应对小分子的降解作用降低，降解速率下降，降解产物的分子量下降速率趋于平缓，这和超声波降解壳聚糖的结果是一致的［8］。另一方面，水力空化降解前期，溶液中气含率较大，空化泡的产生和溃灭导致水分子结合键断裂产生羟自由基和氢自由基。同时，空化泡的溃灭产生高温、高压及高速微射流，促进了降解反应的进行。随着反应时间的延长，气含率降低，空化效应明显减弱，导致了壳聚糖降解速率减缓，分子量的降低也趋于平缓。

图6　0min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图7　10min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图8　20min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图9　30min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图10　40min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图11　50min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图12　60min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图13　70min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图14　80min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图15　90min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图16　100 min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图17　110 min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

图18　120 min的壳聚糖的凝胶渗透色谱图

分子量分布是用来表征高聚物中不同分子量组分的相对含量。分子量分布曲线有两种：一种为积分分布曲线，另一种为微分分布曲线［8］。如图6至图18所示即为壳聚糖不同时间降解产物的分子量微分分布曲线图。分子量分布曲线图的横坐标Slice logMW为每个切片的分子量取以10为底的对数，是由原始色谱图的横坐标转换得到的。宽分布峰被分成多个切片，每个切片与标准曲线上的点相关，便可计算出统计的分子量值，如Mw和Mn等。左侧纵坐标dwt/d（logM）是根据标准曲线并利用公式dwt/d（logM）= （dwt/dV）·（dV/d（logM））转换得到的。表示单位重量分子的重量分数。dwt/dV是单位保留体积对应的重量分数。当标准曲线为曲线时，（dV/d（logM））是由标准曲线不同保留体积的切线斜率的倒数得到的。右侧纵坐标Cumulative % 表示每个切片聚合物的累积百分比。由图6至图18可以看出，在反应10 min时，分子量大于Slice logM=5的含量约占80%，随着反应的进行，分子量大于Slice logM=5的含量逐渐降低，到了第120 min时，其含量约占20%。而120 min时分子量大于Slice logM=5.5的聚合物的含量已低于5%。由图6至图18还可以看出，反应刚开始时10 min，峰值对应的Slice logM约为5.75，随着反应的进行，峰值逐渐向小分子量的方向移动，到120 min时，峰值对应的Slice logM约为4.75，也说明了水力空化反应前所占比例较多的大分子量壳聚糖在逐渐减少，小分子量的壳聚糖在逐渐增加。

图19　分散度与降解时间的关系

由图19可以看出，壳聚糖降解产物分散度的变化大致可以分为三个阶段，0 min～30 min 快速下降阶段，30 min～70 min 时的波动阶段，70 min～120 min 的缓慢下降阶段，可以看出总体趋势是减小的。这可能是因为原料壳聚糖的分散度较大，壳聚糖分子的大小差别较大。在空化反应的0 min～30 min，壳聚糖中的大分子的含量较高，空化效应强，降解反应主要是大分子的糖苷键被破坏，降解为中等分子量和小分子量的分子，此时大分子迅速减少，这使得分散度迅速下降；当反应进行到30 min～70 min，反应主要为中等分子量的分子，既生成也被降解的，体系中大分子、中分子以及小分子均占有一定的比例，降解反应在各类分子中均可发生，使得分散度没有明显下降而表现为上下波动；随着降解反应的进一步进行，到了70 min～120 min 时，大分子量的分子几乎被完全降解，降解主要发生在中分子，小分子量的分子逐渐增多，此时的壳聚糖分子大小也趋于一致，这就表现为分散度与分子量大小同步减小。笔者还可以看出，当反应到120 min时，分散度为3.87，并没有达到1左右，这可能是由于空化的强度减弱，能够有效切断小分子量壳聚糖中糖苷键的难度加大，使得小分子量的分子难于继续降解，分子间的大小差别也变化不大。

表1　不同时间降解产物分子量及分散度

3　结论

采用单因素实验方法对水力空化降解的实验条件进行研究，得到优化的实验条件为壳聚糖溶液浓度为3g·L-1，溶液pH值为4.4，反应温度为40℃，入口压力为0.4MPa，反应时间为120min，水力空化反应装置文丘里管的入口角度为60°，出口76°，喉部长度为10mm，喉部直径为4mm。

通过凝胶渗透色谱法测定了水力空化降解壳聚糖不同时间产物的分子量及其分布。结果表明，水力空化可以有效降解壳聚糖。壳聚糖的数均分子量、重均分子量、z均分子量、z+1均分子量均有显著下降。并且水力空化降解壳聚糖的产物的分子量分布变窄，分散度由6.96下降到3.87。

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Study on the molecular weight distribution of the degradation of chitosan by hydrodynamic cavitation

In this paper， based on the optimum conditions for the degradation of chitosan by hydrodynamic cavitation， the molecular weight distribution of the chitosan degradation products at different time was determined by gel permeation chromatography. The results showed that the effect of hydrodynamic cavitation on the degradation of chitosan was obvious， the molecular weight of chitosan degradation products decreased significantly， and the degree of dispersion of the degradation products decreased compared with the raw chitosan.

Chitosan； hydrodynamic cavitation； gel permeation chromatography； molecular weight distribution

Q53

A

1008-1151（2016）02-0068-06

2016-01-15

国家自然科学基金项目（31160348）；广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划（桂教人〔2014〕7 号）。

张帆（1989－），女，广西科技大学生物与化学工程学院硕士研究生，研究方向为生物资源加工及过程强化。